蛋白質工学的手法による細菌シトクロムc耐熱機構の解明

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01470122
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 児玉 徹 東京大学, 農学部, 教授 (30011901)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石井 正治 東京大学, 農学部, 助手 (30193262)
• Keywords: シトクロムc / 耐熱化機構

Research Abstract

1。細菌由来シトクロムc遺伝子の大腸菌における発現
(1)<Hydrogenobacter thermophilus>___ーシトクロムc__ー_<552>遺伝子より、site directed mutagenesisの手法を用い、シグナル配列を含むもの(CH11)と含まないもの(CH12)を調製した。
(2)CH11とCH12を含む組換えプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換株を硝酸呼吸条件下嫌気的に培養し、ホロシトクロムc__ー_<552>生産性を確かめた所、CH12を含む組換えプラスミドを用いて形質転換された大腸菌中にのみその生産が確認された。得られたホロシトクロムc__ー_<552>に対し酸性メチルエチルケトン処理を行ってもヘムの離脱が観察されなかったことからヘムCを共有結合として含むホロシトクロムc__ー_<552>が生産されていることが確認された。
(3)上記ホロシトクロムc__ー_<552>の宿主(大腸菌)中の局在性はサイトプラズムであることが確認された。
2。Site directed mutagenesisによるシトクロムc__ー蛋白の熱安定性の改変
(1)<Hydrogenobacter thermophilus>___ーシトクロムc__ー_<552>のαーヘリックス構造を破壊するような変異として、Ala26→Lys、Lys30→Ala、Asp37→Glyを考え、それぞれ変異遺伝子を調製した。
(2)上記変異遺伝子を用いて形質転換した大腸菌を培養し、得られる無細胞抽出液からシトクロムc__ー_<552>の変異蛋白質を調製した。
(3)上記の各種変異シトクロムc__ー_<552>の熱安定性をCDスペクトルの測定により調べた所、シトクロムc__ー_<552>のものとの有意差はなかった。