1989 Fiscal Year Annual Research Report
高等動物における細胞質型及びミトコンドリア型アイソザイム遺伝子の発現制御機構
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01480149
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
島田 和典 熊本大学, 医学部, 教授 (40037354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野見山 尚之 熊本大学, 医学部, 講師 (00156225)
瀬戸山 千秋 熊本大学, 医学部, 講師 (60040250)
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| Keywords | アイソザイム / ミトコンドリア / マウス / 細胞質 / 遺伝子発現 / アスパラギン酸・リンゴ酸シャトル / トランスアミナ-ゼ / リンゴ酸脱水素酵素 |
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| Research Abstract |
1.マウスmAspAT、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の5'隣接領域の種々の長さのDNA断片とneo遺伝子を融合させた組換え体を作製した。そして、これらの組換え体をマウス線維芽細胞NIH3T3に導入後、neo遺伝子の発現を指標にして、各々の遺伝子の発現に必須なDNA領域を決定した。
2.先ず、transientな系を用いて、neo RNAのレベルをノ-ザン・ブロット法により解析した。その結果、mAspAT遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流177bpと165bpの間の領域が、また、cAspAT遺伝子の発現には翻訳開始点より上流263bpと217bpの間、及び203bpと159bpの間の領域が重要な役割を果たしている事が判明した。G418耐性細胞の出現頻度を調べるpermanentな系を用いても同様な結果が得られた。
3.全く同じ方法を用いて、mMDH遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流270bpと130bpの間の領域(P1)が、またcMDH遺伝子の発現には253bpと170bpの領域が必須であることを見いだした。
4.この様にして同定した発現調節領域内に一致して、核タンパクの結合を認めた。また、mAspAT遺伝子の転写調節にはSp1が、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の転写調節にはCTF/NF1が関与していることを見いだした。
5.アイソザイム遺伝子の発現調節領域の解析過程で、mMDH遺伝子に関しては第2のプロモ-タ-(P2)が存在していることを見いだしたため、これら二つのプロモ-タ-の機能を比較解析した。
6.新たに購入した蛍光イルミネ-タ-はDNAの構造解析の為に使用し、またパルスフィ-ルドゲル電気泳動装置はヒトcAspAT遺伝子をプロ-ブとして用いて、染色体上でのこの遺伝子を中心とした染色体領域の詳細な制限酵素切断地図の作製を進める実験に使用する予定である。
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[Publications] F.Nagashima: "cDNA cloning and expression of pig cytosolic aspartate amino-transferase in E.coli:Amino-terminal heterogeneity of expressed products and lack of its correlation with enzyme function" Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)
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[Publications] T.Nishi: "Import and processing of mitochondrial aspartate aminotransferase:Structure-function relationship of the presequence" J.Biol.Chem.264. 6044-6051 (1989)
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[Publications] C.Setoyama: "Regulatory regions of the mitochondrial and crtosolic isoenzyme genes participating in the malate-aspartate shuttle" J.Biol.Chem.265. 1293-1299 (1990)
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[Publications] Y.Morino: "Mammalian aspartate aminotransferase isozymes:From DNA to protein" Annals New York Acad.Sci.(1990)
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[Publications] K.Shimada: "Molecular structures and evolution of the mouse isozyme genes functioning in the malate-aspartate shuttle.In“Isozymes:Structure,Function,and its Use in Biology and Medicine"" A.R.Liss Publishing Co.,New York,
