DNA増幅によるヒト・サイトメガロウイルス検出法の開発とその応用

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01480261
• Research Institution: Sapporo Medical College
• Principal Investigator: 千葉 峻三 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50045374)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 信寛 札幌医科大学, 医学部, 助手 (50216420) ; 吉田 幸一 札幌医科大学, がん研究所, 講師 (60117653) ; 山中 樹 札幌医科大学, 医学部, 助教授 (70045508)
• Keywords: ヒト・サイトメガロウイルス / DNA検出法 / ポリメラ-ゼ連鎖反応 / PCR法

Research Abstract

昨年度はヒト・サイトメガロウイルス(HCMV)のLA領域のプライマ-を用いたPCR法を開発し、尿検体からのHCMV検出において有用性が示された。今年度はHCMVの再活性化を捕捉する手段としてCombined reverse transcriptionーPCR法(RTーPCR法)を開発した。
1.HCMV・AD169株のimmediate early(IE)領域にDNAで346bp、RNAで232bpの増幅断片を設定してprimerを作成した。PCRはSaikiらの方法に準じ、DNA Thermal Cyclerを用いて30サイクル増幅した。ウイルスmRNAの検出は、検体から抽出したRNAにreverse transcriptaseを作用させてcDNAを合成してPCRを行った。
2.作成したプライマ-はHCMVのDNAを増幅したが他のヘルペス科ウイルスDNAやMRCー5細胞DNAを増幅せず、特異性が確かめられた。また、検出感度を検討した結果、10^<ー3>〜10^<ー4>pgのHCMV・DNAの検出が可能であった。
3.HCMVをMRCー5細胞に感染させたあと経時的にmRNAの検出を試みたところ、感染後24、48、72時間では検出できたが、96時間以降は検出できなかった。
4.前年度に報告したLAのプライマ-と今回作成したIEのプライマ-を併用することにより、DNAレベルでのHCMVの検出はより確実となった。また、in vitroの系でRTーPCRによりmRNAが検出し得たことから、今後臨床検体について潜伏感染時と再活性時のIEのmRNAの発現状態について検索することが可能になった。

Research Products

• [Publications] 母坪 智行ほか: "Polymerase Chain Reaction法によるヒトサイトメガロウイルスDNA検出法の開発" 札幌医学雑誌. 59. 153-163 (1990)
• [Publications] 母坪 智行ほか: "PCR法によるヒトサイトメガロウイルスDNAの検出" 蛋白質核酸酵素・臨時増刊号. 35. 3048-3054 (1990)
• [Publications] 母坪 智行ほか: "DNA増幅法(PCR)の開発とその応用 4)サイトメガロウイルス" 小児科診療・特大号. (1991)
• [Publications] 千葉 峻三: "小児科の進歩11(小児科学年鑑)" 診療と治療社, (1991)