1989 Fiscal Year Annual Research Report
部位特異性突然変異法によるトランスアミナ-ゼ活性域の研究
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01480524
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
鏡山 博行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80028555)
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| Keywords | 部位特異性突然変異 / トランスアミナ-ゼ / アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / 基質認識 / 酵素反応機構 / 酵素の活性中心 / 蛋白質工学 |
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| Research Abstract |
X線結晶解析デ-タにもとづいて、site-direeted mutagenesisの手段によって大腸菌アスパラギン酸トランスアミナ-ゼの部異特異的変異体を多種作成した。基質であるジカルボン酸を認識しているArg292、Arg386、触媒反応に直接係っていると考えられるTyr70、Tyr225、Lys258、Asp222、His148などを対象とした。
基質のαーカルボキシル基、側鎖のカルボキシル基は各々Arg386とArg292に結合していることが結晶解析で分っている。これらのArgをLysに置換した酵素では、いずれの場合も活性は大きく低下し、基質の認識は単なる電荷の問題ではなく、より厳密な相互作用、例えば二本の水素結合による遷移状態の安定化が必要であることが明らかとなった。Arg292をLeu、Valに置換した場合、芳香族アミノ酸への特異性が増大し、特にVal置換体ではその影響が著しいことが分った。目下、全アミノ酸への置換体を作り、基質特異性変換への詳細を解析中である。
Lys258をAlaやMetで置換すると、反応はある段階次降進行しなくなることが分り、反応過程の中で、Lys258が基質アミノ酸のαープロトンを引抜く触媒基であるという仮説を証明し得た。〔Asp222→Ala,Asn,Glu〕変異体を用いた実験からは、222位に負電荷が必要なこと、〔Tyr225→Phe〕変異体で活性が無くなることから、225位はチロシンでなければならないことが示された。補酵素を中心に行われるプロトンの移動をこれらの残基が助けることによって触媒効率を高めている状況を、結晶解析の結果と併せ考えつつ、理論的に説明することができるにいたった。Tyr70の役割について、補酵素のつなぎとめという報告がなされていたが、基質認識にも働いている可能性を示す成績がPreliminaryに得られつつある。
今後さらに変異体の種類を増やし、活性中心のアミノ酸残基の機能について詳細な検討を進めたい。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] Hideyuki Hayashi: "〔Arg292→Val〕or〔Arg292→Leu〕Mutation Enhances The Reactivity of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase with Aromatic Amoni Acids" Biochem.Biophys.Res.Commun.151. 337-342 (1989)
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[Publications] Shigehiko Kamitori: "Crystallization and Preliminary X-Ray Characterization of Branched-Chain Amino Acid Aminotransferase From Escherichia Coli" J.Biochem.105. 671-672 (1989)
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[Publications] Yasushi Inoue: "Substitution of A hysyl Residue For Arg386 of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" J.Biol.Chem.264. 9673-9681 (1989)
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[Publications] Fujio Nagashima: "cDNA Cloning and Expression of Pig Cytosolic Aspartade Aminotransferase in Escherichia coli:Amino Terminal Heterogeueity of Expressed Products And Lack of Its Correlatiun with Enzyme Function" Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)
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[Publications] Katsuyuki Tanizawa: "The Primary Structure of Thermostable D-Amino Acid Aminotransferase From a Thermophilic Bacillus Species,And Its Correlation with 1-Amino Acid Anminotransferarse" J.Biol.Chem.264. 2450-2454 (1989)
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[Publications] Seiki Kuramitsu: "Presteady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase-Catalyzed Reactions And Thermoslynamic Aspect of Its Substrate Specificity" Biochemistry. (1990)
