1991 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
01480543
|
|---|
| Research Institution | Saitama University |
|---|
Principal Investigator |
伏見 譲 埼玉大学, 工学部, 教授 (80011641)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 美穂 埼玉大学, 工学部, 助手 (60222064)
宮下 晃 埼玉大学, 工学部, 助教授 (90132729)
|
|---|
| Keywords | 核酸 / DNA / 二次構造 / 変性ゲル電気泳動 / 安定性 / プライマ-伸長反応 / PCR / イオン感応性電界効果トランジスタ |
|---|
| Research Abstract |
1.準安定2次構造の予測:Ffファ-ジ-本鎖DNAを鋳型とし,種々のプライマ-を用いて伸長反応を行わせた後,制限酵素の切断パタ-ンを解析すれば,鋳型鎖の準安定2次構造やプライマ-結合特異性のデ-タが得られる。後者に注目し,2次構成形成の熱力学的パラメ-タを用いた理論計算結果と比較した。実験結果を概ね説明できるが,理論モデルとパラメ-タを改良してさらに精密化する必要がある。この応用として,プライマ-の特異性を低くしてPCRを行い,その結果を温度勾配ゲル電気泳動で分析することにより,鋳型DNAの分類を行うDNAプロフィ-リング法を開発したが,そのプロフィ-ルを理論的に求めるプログラムを開発した。
2.核酸構造とゲル電気泳動易動度との関係:ゲル電気泳動を行うと同時にゲルの温度を,DNAの変性温度付近で変化させれば,DNAの2次構造の熱安定性を電気泳動易動度の差として検出できる。この温度掃引ゲル電気泳動法を開発した。この方法の理論を確立し,従来の温度勾配ゲル電気泳動法と比較したところ,多くの場合わずかに良い分解能が得られることがわかった。GCクランプ法と併用し,260塩基の内の1塩基置換を実験的に検出した。
3.DNA合成反応速度に基づく準安定構造の測定:開発済のISFET差動型pHセンサ-を用いると20μlの反応液中のpH変化を時間分解能2秒で測定できる。DNAポリメラ-ゼによる鋳型合成反応は水素イオンの吸収を伴うので,緩衝能を低くしておけば,この反応の時間経過を,この微小センサ-で測定できる。プロセシビティが中庸のクレノ-酵素を用いて反応速度を測定した結果,鋳型鎖に準安定2次構造がない領域では,伸長反応は速く,多い領域では遅く,安定なヘアピン構造の根元では,伸長が止る傾向にあるとの知見を得た。
|
-
[Publications] Yoshino,K.: "Temperature Sweep Gel Electrophoresis:A Simple Method to detect point mutations" Nucleic Acids Research. 19. 3153-3153 (1991)
-
[Publications] Nishigaki,K: "DNA Profiling.An Approach of Systematic Characterization,Classification,and Comparison of Genomic DNAs" Chemistry Letters. 1097-1100 (1991)
-
[Publications] 西垣 功一: "生体高分子の構造解析および分離技術としての変性勾配ゲル電気泳動法の進展" 蛋白質・核酸・酵素. 36. 1747-1755 (1991)
-
[Publications] Nishigaki,K: "Structural Analysis of Nucleic Acids by Precise Denaturing Gradient Gel Electrophoresis:I.Methodology" J.Biochemistry. 111. 144-150 (1992)
-
[Publications] Nishigaki,K: "Structural Analysis of Nucleic Acids by Precise Denaturing Gradient Gel Electrophoresis:II.Applications to the Analysis of Subtle and Drastic Mobility Changes" J.Biochemistry. 111. 151-156 (1992)
-
[Publications] Sakurai,T.: "Realーtime Monitoring of DNA Polymerase Reactions by a Micro ISFET pH Sensor" Analytical Chemistry. (1992)
