リピド中間体生合成に働くヒト・マンノ-ス転移酵素活性関連遺伝子のクロ-ニング

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01560109
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 西川 義尚 (財)東京都臨床医学総合研究所, 腫瘍細胞, 研究員 (20109953)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 行男 (財)東京都臨床医学総合研究所, 腫瘍細胞, 研究員 (80124501)
• Keywords: リピド中間体 / cDNA / クロ-ニング / 温度感受性変異株 / アスパラギン結合型糖鎖 / 糖転移酵素 / トリチウム自殺法 / 粗面小胞体

Research Abstract

当研究代表者がFM3A細胞から^3Hーマンノ-スを用いたトリチウム自殺法による選択を経て分離した糖蛋白のアスパラギン(Asn)結合型糖鎖生合成に関する変異株G258は、(1)細胞増殖に関して温度感受性(ts)であり、(2)Asu結合型糖鎖生合成に関してtsである。そして、その変異はAsu結合型糖鎖の前駆体であるリビド中間体(LI)の生合成の段階にある。すなわちG258株は、低温では完全糖鎖のLI(GIc_3Man_9GIcNAc_2ーPーPードリコ-ル)を合成できるが、高温では不完全糖鎖のMan_3GIcNAc_2ーPーPードリコ-ルまでしか合成できず、マンノ-ス転移酵素活性の発現に関するts変異株である。昨年度までに、G258株の(1)および(2)の変異形質は単一遺伝子変異に由来することを明らかにした。この結果から、G258株の脂肪増殖の温度感受性からの回復を指標に、G258株のLI生合成変異に相補的なcDNAのクロ-ニングが可能になった。そこで、本年度は、阪大微研岡山博人教授からヒト肝臓cDNAライブラリ-(ジェネティシン耐性マ-カ-を持つpcD2ベクタ-に組み込まれている)を譲り受け、クロ-ニングに着手した。まず、トランスフェクションの方法を、リン酸カルシウム共沈法および電気穿孔法について検討した。その結果、浮遊細胞であるG258株には電気穿孔法が適していた。また、ジェネティシン感受性は用いる培地によって異なっていた。これらの結果をもとに、cDNAライブラリ-をG258株に移入し、ジェネティシン含有RPMI1640寒天プレ-トでの高温培養で選択した。こうして形成されたコロニ-を更に、単一コロニ-分離法で純化し、得られた株を第1次トランスフォ-マントの候補株として集積している。現在までに2株得ている。来年度は、第1次トランスフォ-マントDNAをG258株に移入し、第2次トランスフォ-マントを得、更に、目標cDNAを大腸菌に回収する。

Research Products

• [Publications] 西川義尚: "小胞体膜におけるリピド中間体生合成のトポグラフィ-" 化学と工業. 42. 906-908 (1989)
• [Publications] 西川義尚: "細胞増殖因子レセプタ-の機能発現におけるアスパラギン結合型糖鎖のかかわり" バイオサイエンスとバイオインダストリ-. 47. 930-935 (1989)
• [Publications] 西川義尚: "糖タンパクの細胞内輸送におけるアスパラギン結合型糖鎖の機能" 日本農芸化学会誌. 64. (1990)
• [Publications] Yoshihisa Nishikawa: "Revertauts of a temperatureーseusitive FM3A mutant defective in the syntheses of lipidーlinked Oligosaccharide"
• [Publications] 西川義尚: "日本生化学会編「新生化学実験講座」第3巻「糖質」I.糖タンパク質§9.1.3Nーアセチルグルコサミンの導入" 東京化学同人,
• [Publications] 西川義尚: "日本生化学会編「新生化学実験講座」第3巻「糖質」I.糖タンパク質§9.1.5オリゴ糖転移" 東京化学同人,