植物のカドミウム刺激適応に動員される防護活性ペプチドに関する研究

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01560146
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 今井 邦雄 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (80109313)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小畑 仁 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (70024594)
• Keywords: キャディスティン / カドミウムイオン / 高速液体クロマトグラフィ- / グルタチオン / カルボキシペプチダ-ゼ / 酵素合成

Research Abstract

昨年度の研究によりキャディスティン類を特異的に紫外線吸収あるいは蛍光性を有する誘導体とし、高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)を用い、高感度に分析する手法を確立した。さらに本手法を用いることにより、Cd^<++>処理及び無処理の稲の根中のキャディスティン類を分析して無処理の場合に主要SHヘプチドであるグルタチオンがCd^<++>処理により極度に減少し、キャディスティン類が誘導合成されてくる事と、無処理の場合でさえも極めて少量ながらキャディスティン類が含まれている事を見いだしている。本年度はこれら分析の標準試料となるべき、かつ、抗体作成のための抗原となるべきキャディスティン類を酵素合成する手法の確立をめざした。この酵素反応には構造決定の際に見いだしているカルボキシペプチダ-ゼの新奇な特異性を用いた。すなわち、カルボキシペプチダ-ゼはキャディスティン類の正常なCysーGly結合を切断するのみならずGluのαカルボキシル基をC末端として認識してCysーGlu結合を切断するがγーGluーCys結合は切断できないという特異性を利用し、グルタチオンを基質としてカルボキシペプチダ-ゼY処理によりキャディスティン類の合成を目指した。酵素反応生成物をHPLC分析した結果、6種の生成物を得、生成物のHPLC上の挙動、昨年度開発した誘導体化後のHPLC上の挙動およびSIMS分析の結果から主要な2種の生成物はキャディスティン(γーEC)_2Gと(γーEC)_3Gであることを明らかにすることができた。
さらに、その他の生成物はγーEC,(γーEC)_2と(γーEC)_3、および(γーEC)_2から脱水した生成物である事が判った。以上の結果を総合してグルタチオンのカルボキシペプチダ-ゼによる代謝経路を明らかにすると同時に、アミノ酸の保護や特殊な有機合成の技術を必要とせず、一段階の反応のみで極めて容易にキャディスティン類を酵素合成する道を開く事ができた。現在、この手法を発展させて大量合成法を開発している。

Research Products

• [Publications] Hitoshi Obata: "Separation and fluorometric determination of (γEC)nG,components of class III metallothioneine,by high performance liquid chromatography" Phytochemical Analysis.
• [Publications] Kunio Imai: "A facile HPLC analysis of cadystins as Sーpyridylethyl derivatives"
• [Publications] Kunio Imai: "Enzymic synthesis of cadystins"
• [Publications] Minoru Isobe: "Metal Binding in SulfurーContaining proteines Editted by M.Stillman et al “Structures and Biosynthesis of Cadystins Comprising Cadmium Binding Peptides Induced in Fission Yeast"" VCH Publishers,