培養神経細胞ペプチド分泌の単一細胞レベルの可視化と定量解析

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01570070
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 有田 順 横浜市立大学, 医学部生理学講座, 助教授 (80128587)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 豊 横浜市立大学, 医学部生理学講座, 助手 (90194050) ; 橋本 隆平 横浜市立大学, 医学部生理学講座, 助手 (70189512)
• Keywords: 神経細胞 / 分泌 / 神経ペプチド / 視床下部 / 可視化 / 定量法

Research Abstract

1(1)胎生18日令ラットの視床下部を酵素処理により分散し、得られた単一視床下部細胞を単層培養した。
(2)培養細胞からのソマトスタチン分泌量は少ないことが予想されたので、ベトリディッシュ上に培養した視床下部神経細胞から培養液中へ分泌されるソマトスタチンをradioimmunoassayで測定することにより、ソマトスタチン分泌が最大となる至適培養条件及び培養期間を決定した。細胞分散に用いる酵素はコラ-ゲナ-ゼが、培地はダルベッコ変法イ-グル培地が、添加血清は10%馬血清、5%胎児血清が適当であることがわかった。以上の培養条件で培養後、培養液へのソマトスタチン分泌量は漸増し、9-12日後にピ-クとなることが明らかになった。
(3)細胞ブロットはカバ-スリップ上の培養神経細胞を用いて実際には行なうので、カバ-スリップ及び細胞接着因子の選定を行ない、コラ-ゲン被覆プスティックカバ-スリップを使用することを決めた。
2.単一培養視床下部細胞からのソマトスタチン分泌の可視化にはまだ成功していない。その理由として、(1)染色した時に転写膜のバックグランドが非常に濃かった。現在使用中のソマトスタチン抗体がソマトスタチン-牛血清アルブミン(BSA)結合物に対するものであるため、転写膜とのインキュベ-ト時に使用している培地中のBSA、及び、転写膜のブロッキングに使用しているBSAが染色されたものと考えられる。現在、ソマトスタチン-サイログロブリン結合物に対する抗体の使用を検討中である。(2)1時間インキュベ-トによる基礎分泌量が感度以下であった。これに対しては、高カリ脱分極刺激を含む種々のソマトスタチン分泌刺激の適用を考えている。