1989 Fiscal Year Annual Research Report
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01570134
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
筒井 研 岡山大学, 医学部, 助教授 (70108158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
保田 立二 岡山大学, 医学部, 教授 (30092357)
渡来 仁 岡山大学, 医学部, 助手 (50175139)
筒井 公子 岡山大学, 医学部, 助手 (70144748)
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| Keywords | 核骨格 / 核マトリックス / RNA転写 / 超らせんDNA / DNA結合蛋白質 |
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| Research Abstract |
1.ビオチンで標識した超らせんDNAをプロ-ブとして用いるサウスウェスタン法を開発し、核骨格のDNA結合蛋白質として、すでに報告した分子量120KDaの蛋白質以外に、75K,34K,15Kのものを同定した。未標識DNAによる競合実験の結果、75K蛋白質は超らせんDNAに対する高い特異性を有していたが、120K蛋白質にはこの特異性がみられなかった。ペプチドマッピングを行うと、120Kと75K蛋白質の一次構造に類似性が認められた。また、超らせんDNAを弛緩させる薬剤で分離核を処理すると、75K蛋白質が選択的に抽出されることがわかった。現在、この性質を利用して75K蛋白質の精製を行っている。ラットの核骨格標品を抗原とし、ウェスタン法でスクリ-ニングすることにより、120K蛋白質に対するマウスのモノクロ-ナル抗体(IgM)を得た。
2.この抗体はDNAの120K蛋白質の結合には何の影響も与えないが、逆にDNAは120K蛋白質と抗体の反応性を著しく増強することから、120K蛋白質はDNAと結合すると何らかの構造変化を起こすと思われる。この抗体を利用した蛍光抗体法で120K蛋白質の細胞内分布を調べた結果、核の周辺部と核内のネットワ-ク状構造が強く染色され、120K蛋白質の核骨格への局在が裏づけられた。
3.ゲル電気泳動で精製した120K蛋白質を用いてN末端アミノ酸配列の決定を試みたが、N末端がブロックされているらしく不成功に終わった。現在CNBr断片を作り内部配列を解析している。
4.核骨格を構成要素として含むin vitro転写系の予備実験として、超らせん鋳型DNA、核骨格およびRNAポリメラ-ゼ/転写因子を含む核抽出液から成る系を作り鋳型DNAの構造変化を調べたところ、超らせんDNAは急速に弛緩型に転換された。この系で鋳型の高次構造の効果を評価するにはトポイソメラ-ゼを完全に阻害する必要がある。
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[Publications] Ken Tsutsui: "Incorporation of Exogenous Circular DNA into Large Catenated Networks in Isolated Nuclei.Evidence for Involvement of the Nuclear Scaffold" The Journal of Biological Chemistry. 264. 7644-7652 (1989)
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[Publications] 筒井研: "核マトリックスDNA結合部位" 生体の科学. 40. 529-532 (1989)
