Clostridium difficileトシキンAの構造と機能の解析

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01570231
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 中村 信一 金沢大学, 医学部, 教授 (90019620)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山川 清尺孝 金沢大学, 医学部, 助手 (20110629) ; 神谷 茂 金沢大学, 医学部, 講師 (10177587)
• Keywords: C.difficile / トキシンA / 電気泳動 / サブユニット / モノクロ-ナル抗体 / 酵素抗体法 / 中和活性

Research Abstract

Clostridium difficileトキシンAの構造と機能について検討した。トキシンAの精製はサイログロブリンアフィニティクロマトグラフィ-に2種の陰イオン交換カラムクロマトグラフィ-(Qセファロ-スFF,モノQ)を併用する改良法に依った。最終標品は来変性PAGE上分子量520〜540KDaの単一パンドとして泳動された。本精製毒素は非還元下でのSDS-PAGEの結果分子量240KDaの主バンド、分子量38〜345KDaの10種のマイナ-バンド及び分子量46〜440KDaの27種のフェイントバンドとして泳動され、またβ-メルカプトエタノ-ルを添加し還元下でSDS-PAGEを行うと分子量240KDaの主バンド、38〜345KDaの4種のマイナ-バンド及び分子量46〜440KDaの31種のフェイントバンドとして泳動された。2次元電気泳動の結果、非還元下で検出された分子量255〜345KDaの7種のマイナ-バンドは還元後240KDaの主バンドに変化することが明らかとなった。これらの結果はトキシンAは240KDaよりも小さな分子量をもつサブユニットから構成されている可能性を示唆する。モノクロ-ナル抗体(MAb)作成の為、トキソイド化精製トキシンAによりマウスを免疫した。摘脾後脾細胞をマウスミエロ-マ細胞(P_3×63,AG_8-653)とポリエチレングリコ-ルにて融合させた。ハイブリド-マの選別は常法に従った。MAb産生のスクリ-ニングは精製トキシンAを吸着させたプレ-トを用いた酵素抗体法(ELISA)によった。現在までに2E15,2Q15,3B4の3種のMAb産生細胞株が樹立された。これらのMAbのサブクラスは全てIgM,Kappaであり、ELISA値(DD_<405>≧0.2を示す最大希釈倍数の逆数)はそれぞれ10^7,10^6,10^8であった。これらのMAbはいずれもトキシンAの細胞毒素、マウス致死活性、エンテロトキシン活性、血球凝集活性等の生物活性を中和できなかった。現在トキシンAの生物活性に対する中和能を有するMAb産生細胞の樹立に向け研究が続けられている。

Research Products

• [Publications] 中村信一: "クロストリディウム・ディフィシルの病原因子" 医学細菌学. 5. 56-97 (1990)
• [Publications] Shigeru Kamiya: "Recovery of spores of Clostridium difficile altered by heart of alkali" Journal of Medical Microbiology. 28. 217-221 (1989)
• [Publications] Shigeru Kamiya: "Purification and characterization of Clostridium difficile toxin A by bovine thyroglobulin affinity chromatography and dissociation in denaturing conditions with or without reduction" Journal of Medical Microbiology. 30. 69-77 (1989)
• [Publications] Shigeru Kamiya: "Characterization of Clostridium difficile toxin A by monoclonal antibodies" FEMS Microbiol.Letters.