1990 Fiscal Year Annual Research Report

コレラ菌とビブリオ・バルニフィカスの細胞破壊毒が共有するドメインの遺伝学的解析

Research Project

Project/Area Number	01570236
Research Institution	Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University
Principal Investigator	山本耕一郎大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (30158274)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	余明順大阪大学微生物病研究所, 助手 (70093482)
Keywords	毒素 / コレラ菌 / 溶血素 / サイトディレクティド変異 / バルニフィカス菌 / クロ-ン化 / 塩基配列 / タンパク毒素
Research Abstract	エルト-ルコレラ菌とVibrio vulnificusの産生する易熱性溶血毒に連続して8個のアミノ酸配列が共通しているドメインが存在している.このドメインをコ-ドしている塩基配列で,昨年度までの研究でhlyAの6個のアミノ酸を置換したが,本年度さらに4個の変異遺伝子をsiteーspecific mutagenesis法で作製することができた.内訳は(1)各アミノ酸の電荷の極性を逆にする置換,3個,(2)親疎水性を逆転させる置換5個,(3)コドン中の第3番目の塩基がpointーmutationによってアミノ酸置換を起こす場合,そのアミノ酸に置換したもの2個の合計10個である. 各変異クロ-ンを発現ベクタ-にサブクロ-ン化し,大腸菌内でOVERーPRODUCTIONをおこなった.菌体内から変異溶血毒を得,カラムクロマトグラフィ-によって変異溶血毒を部分精製し,ELISAによって抗原量を測定した.その結果から抗原量を一定にして,トリプシンで処理し活性化をおこなった.ウェスタンブロットの結果から各変異溶血毒もnativeな溶血毒と同様にトリプシンによって79kDa protoxinから65kDa mature toxinにプロセッシングを受けることが判明した.このことは変異がプロセッシングには影響しないことを示している.プロセッシングされたサンプルの抗原量を一定にして羊赤血球に対する活性を測定した.その結果,いずれの変異溶血毒も十分の一以下に比活性が低下していた.以上の結果はこのドメインが活性発現に重要な役割を果たしていることを示唆している.特に,VAL230をGLUに置換した場合活性はほとんど見出されなかったことから,この部位での疎水性が活性に関与しているものと考えられる.

Research Products

(7 results)

All Other

All Publications (7 results)

[Publications] Yamamoto,K.: "The cytolysin gene of Vibrio vulnificus i:Sequence and relationship to the Vibrio cholerae hemolysin gene" Infection and Immunity. 58. 2706-2709 (1990)
[Publications] Iida,T.: "Cloning and expression of two genes encoding highly homologous hemolysins from a Kanagawaーphenomenonーpositive Vibrio parahaemolyticus T4750 strain." Gene. 93. 9-15 (1990)
[Publications] Yamamoto,K.: "Twoーstep procssing for activation of the cytolysin/hemolysin of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor:nucleotide sequence of the structural gene (hlyA) and characterization of the processed products." Infection and Immunity. 58. 4106-4116 (1990)
[Publications] Honda,T.: "Characterization of a new thermostable direct hemolysin produced by a kanagawaーnegative clinical isolate of Vibrio parahaemolyticus." Journal of General Microbiology. (1991)
[Publications] Tamatsukuri,S.: "Detection of heatーlabile enterotoxi gene in enterotoxigenic Escherichia coli by densitometric evaluation using highly specific enzymeーlinked oligoーnucleotide probes."
[Publications] Yamamoto,K.: "Processing and activation of Vibrio cholerae hemolysin precusor by the V.cholerae soluble hemagglutinin/protease and trypsin."
[Publications] 本田武司: "Vibrio cholerae nonー01の産生する多様な病原毒素 (医学細菌学5巻,三輪谷俊夫監修)" 菜根出版(東京), 31 (1990)

1990 Fiscal Year Annual Research Report

コレラ菌とビブリオ・バルニフィカスの細胞破壊毒が共有するドメインの遺伝学的解析

Principal Investigator

山本 耕一郎 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (30158274)

Research Products

[Publications] Yamamoto,K.: "The cytolysin gene of Vibrio vulnificus i:Sequence and relationship to the Vibrio cholerae hemolysin gene" Infection and Immunity. 58. 2706-2709 (1990)

[Publications] Iida,T.: "Cloning and expression of two genes encoding highly homologous hemolysins from a Kanagawaーphenomenonーpositive Vibrio parahaemolyticus T4750 strain." Gene. 93. 9-15 (1990)

[Publications] Yamamoto,K.: "Twoーstep procssing for activation of the cytolysin/hemolysin of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor:nucleotide sequence of the structural gene (hlyA) and characterization of the processed products." Infection and Immunity. 58. 4106-4116 (1990)

[Publications] Honda,T.: "Characterization of a new thermostable direct hemolysin produced by a kanagawaーnegative clinical isolate of Vibrio parahaemolyticus." Journal of General Microbiology. (1991)

[Publications] Tamatsukuri,S.: "Detection of heatーlabile enterotoxi gene in enterotoxigenic Escherichia coli by densitometric evaluation using highly specific enzymeーlinked oligoーnucleotide probes."

[Publications] Yamamoto,K.: "Processing and activation of Vibrio cholerae hemolysin precusor by the V.cholerae soluble hemagglutinin/protease and trypsin."

[Publications] 本田 武司: "Vibrio cholerae nonー01の産生する多様な病原毒素 (医学細菌学5巻,三輪谷 俊夫監修)" 菜根出版(東京), 31 (1990)

山本耕一郎大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (30158274)

[Publications] 本田武司: "Vibrio cholerae nonー01の産生する多様な病原毒素 (医学細菌学5巻,三輪谷俊夫監修)" 菜根出版(東京), 31 (1990)