1989 Fiscal Year Annual Research Report

細菌内毒素刺激でリン酸化される細胞内蛋白質の精製、構造決定とそのキナ-ゼ特異性

Research Project

Project/Area Number	01570243
Research Institution	Jichi Medical University
Principal Investigator	四宮博人自治医科大学, 医学部, 講師 (80162618)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中野昌康自治医科大学, 医学部, 教授 (70048958)
Keywords	細菌内毒素(LPS) / マクロファ-ジ / リン酸化蛋白質 / C3H@HeJマウス / PP65 / 新しい蛋白質
Research Abstract	(1)純系マウス(C3H/He)マクロファ-ジ(Mφ)を^<32>P正リン酸でラベル後、変の細菌内毒素(LPS)で刺激し、Mφ内に出現するリン酸化蛋白(phospho protein;PP)を定量した。刺激後、15-30分で、数種のPPが出現し、これはモノカインの産生などのMφの最終応答に先行した。(2)これらのPPはMφ内で特長的に局在していた。即ち、PP65とPP28は細胞質分画中に、PP58,PP43,PP33とPP19は細胞膜分画中に、PP105とPP75は両者に、それぞれ局在していた(PPの後の数字は分子量を示す)。また、これらのPPは、LPS不応答性C3H/HeJマウスMφでは認められず、LPSによるMφ活性化において必須の蛋白群と考えられる。(3)これらのPP中、最も強くリン酸化される細胞質蛋白(PP65)を、ゲル濾過カラム、イオン交換HPLCカラム、ハイドロキシアパタイトHPLCカラムにて、単一標品にまで精製した。アミノ酸組成の分析では、Asx,Glx,Leu,Lysが多かった。(4)PP65のN末端は何らかの修飾をうけており、検出できなかった。そこでPP65(100μg)を酵素処理(リシルエンドペプチダ-ゼ)して得た約10個のペプチド中の2個のペプチドをアミノ酸配列を気相シ-クエンサ-にて決定した。得られた配列を既知の蛋白質の配列と比較したところ、一致するものはなく、新しい蛋白質であることがわかった。(5)PP65(100μg)をウサギに免疫して抗血清を得た。この抗体を用いて、蛍光抗体法にてMφ内の局在を調べると、細胞質内にほぼ一様に分布していた。また、本抗体を用いて、ウエスタンブロット法でPP65(非リン酸化蛋白P65を含む)を定量すると、HeJ-Mφにも正常Mφとほぼ同量の蛋白が存在していることがわかった。LPS刺激で生ずるPPが精製、構造決定されたのは初めてのことである。平成元年度の研究計画の全て、及び平成2年度の研究計画の一部がすでに達成された。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Characterization and isolation of phosphorylated proteins in murine macrophages by stimulation with bacterial lipopoly-saccharide."
[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Involvement of a novel phosphoprotein in intracellular process of macrophage activation by bacterial lipopolysaccharide."
[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "High performance liquid chromatographycally-separation of unphosphorylated 65 kDa protein whose phosphorylation is augmented in LPS-stimulated macrophages."
[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "cDNA cloning for a novel cytosolic protein of murine macrophages."
[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Preparation of specific antibody against pp65 from murine macrophages:Examination on the localization of 65 kDa protein in other cells and tissues."
[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Bacterial endotoxin-induced intracellular signal transduction in macrophages.In“Endotoxin in gastrointestinal and liver disease",ed.by Y.Mizuno." Sixth International Congress of Mucosal Immunology,

1989 Fiscal Year Annual Research Report

細菌内毒素刺激でリン酸化される細胞内蛋白質の精製、構造決定とそのキナ-ゼ特異性

Principal Investigator

四宮 博人 自治医科大学, 医学部, 講師 (80162618)

Research Products

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Characterization and isolation of phosphorylated proteins in murine macrophages by stimulation with bacterial lipopoly-saccharide."

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Involvement of a novel phosphoprotein in intracellular process of macrophage activation by bacterial lipopolysaccharide."

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "High performance liquid chromatographycally-separation of unphosphorylated 65 kDa protein whose phosphorylation is augmented in LPS-stimulated macrophages."

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "cDNA cloning for a novel cytosolic protein of murine macrophages."

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Preparation of specific antibody against pp65 from murine macrophages:Examination on the localization of 65 kDa protein in other cells and tissues."

[Publications] HIROTO SHINOMIYA: "Bacterial endotoxin-induced intracellular signal transduction in macrophages.In“Endotoxin in gastrointestinal and liver disease",ed.by Y.Mizuno." Sixth International Congress of Mucosal Immunology,

四宮博人自治医科大学, 医学部, 講師 (80162618)