極微量DNAをクロ-ン化できるシャロミドベクタ-の開発と応用

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01570259
• Research Institution: 国立予防衛生研究所
• Principal Investigator: 斎藤 泉 国立予防衛生研究所, 腸内ウイルス部, 主任研究官 (70158913)
• Keywords: クロ-ン化ベクタ- / シャロミド / B型肝炎ウイルス / C型肝炎ウイルス / PCR法 / ウイルスゲノム

Research Abstract

極微量のウイルスゲノム・cDNAのクロ-ン化を目的として、一連のシャロミドベクタ-(ラムダファ-ジベクタ-と同等のクロ-ン化効率を持ちながら、大きさや構造を自由に改変できるコスミドベクタ-)を作製した。まず一本の肝組織針生検から抽出したDNAの一部、わずか5マイクログラムからB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムの全長をクロ-ンできるシャロミドSを開発した。このベクタ-は制限酵素SalIをクロ-ン化部位に持ち、XhoIで直鎖状にしたHBVゲノムを選択的にクロ-ン化できる特徴を持っている。それにより肝炎患者針生検組織から、このウイルスがコ-ドする逆転写酵素を発現すると思われる新しいHBVRNAの同定に成功した。またさらにこのベクタ-に改良を加えたシャロミドSBを開発した。このベクタ-は、制限酵素SnaBIをクロ-ン化部位に持ち、平滑末端にしたほとんど全てのDNA断片を選択的に(すなわち、インサ-トを持った組換え体のみが大腸菌のコロニ-を作るように)クロ-ン化することができる。これを用いて、タイ国のHBV保因者の血清のわずか1m1からHBVゲノムの全長のクロ-ン化に成功した。この場合、クロ-ン化に用いたXhoIで直鎖状にしたHBVゲノムは再びXhoIを用いて切り出せる点が、シャロミドSよりも優れている。またこのシャロミドSBは、特にPCR法により増幅されたC型肝炎ウイルス(HCV)のcDNAのクロ-ン化にきわめて有用であることが示された。これらのベクタ-の使用法が確立されたことにより、微量のウイルス遺伝子のクロ-ン化がより容易に出来ることになった。

Research Products

• [Publications] K.kajino et al.: "Efficient cloning of hepatifis B virus DNA from single-strand repticative intermediates:appl:cation for S1 mapping of viral RNAs in the human liver tissno." Journal of Medical virology.
• [Publications] K.kajino et al.: "Novel Spliced hepatitis B virus RNA possibly coding for the viral polymerase detected in a patient liver tissue." Journal of Virology.
• [Publications] K.Takeuchi et al.: "Hepatitis C viral cDNA clsnes isolated from a healthy carrier donor implicated in postーtransfusion nonーA,nonーB hepatitis" Gene. (1990)
• [Publications] S.Boonmar et al.: "Isolation of hepatitis B virus genome clone from a hepatitis B patient in Thai." Journal of Medical Virology.