ビオチン化RNAプロ-ブを用いた高感度DNA指紋法の開発

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01570340
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 永盛 肇 琉球大学, 医学部, 教授 (50045605)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長嶺 勝 琉球大学, 医学部, 助手 (20189161) ; 梶原 正弘 琉球大学, 医学部, 助手 (30152656) ; 内間 栄行 琉球大学, 医学部, 助手 (90093377)
• Keywords: 親子鑑定 / DNA指紋法 / ビオチン化プロ-ブ / サザントランスファ-

Research Abstract

本年度はプロ-ブであるMyo-DNAの精製と、SP6RNAポリメラ-ゼによるビオチン標識プロ-ブの作成を主たる目的として実験した。新潟大学から分与されたMyo-DNAを含むプラスミドの増幅はHB101株の大腸菌で行なった。制限酵素EcoRIとBamHIで消化することによりプラスミドからMyo-DNAの切り出しを行なった。切り出されたMyoはゲル電気泳動でサイズマ-カ-との比較から約450bpであり15回のくり返し配列を有するDNAと推定された。Myoのゲルからの回収はDNAセルを用いて行なった。回収率は約70%であり電気泳動により単一のbandであることが確認された。精製されたMyoをpsp65ベクタ-にT4DNAリガ-ゼを用いて挿入し、上記と同様に大腸菌内で増幅した。プラスミドを塩化セシウムの密度勾配超遠心で精製し、BamHIで消化してinearにした。ビオチン化UTPを含む塩基とポリメラ-ゼでRNAプロ-ブを合成した。RNAプロ-ブをBlue Geneで検出すると強陽性でありプロ-ブとして使えるものと思われた。しかし親子鑑定試料を用いてサザントランスファ-して検出を試みたがbandは検出されず感度の点でさらに検討する必要があると判断された。
一方、RI標識したMyoプロ-ブによるDNA指紋は鑑定に使用し得るbandが検出された。DNA指紋の良否に大きな比重を占めるものとしてトランスファ-に使われるメンブレンがあげられる。ナイロンメンブレンの中でもHybond-N^+は従来使用していたGene Screen plusやNytran-Nより高成績であることが判明した。従って今後はHybond-N^+を用いてトランスファ-し、RNAプロ-ブを試す予定である。