βーケトチオラ-ゼ欠損症の分子生物学的検討

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01570522
• Research Institution: Department of pediatrics, Gifu University School of Medicine
• Principal Investigator: 山口 清次 岐阜大学, 医学部・附属病院, 講師 (60144044)
• Keywords: 先天代謝異常 / 有機酸代謝異常症 / βーケトチオラ-ゼ欠損症 / 酵素欠損機構 / 遺伝子解析

Research Abstract

βーケトチオラ-ゼ欠損症は間歇的に起こるケト-シス発作を主徴とする有機酸代謝異常症である。本症は、哺乳類で知られている4種類のチオラ-ゼのうち、ミトコンドリア・アセトアセチルーCoAチオラ-ゼ(T2)の欠損によって起こり、遺伝形式は常染色体劣性遺伝であることが知られている。我々は本症の病因を分子生物学的な面から解明することを目的として、欠損酵素について免疫生化学的手法を用いてで酵素をタンパクレベルで解析し、さらにヒトのT2cDNA,および遺伝子のクロ-ニングを行い、遺伝子レベルでの解析を行った。本研究によって得られた主な成果を以下に要約する。
(1)12例の患者の細胞を用いて、酵素欠損機構をタンパクレベルでの解析を行った結果、検出されたT2タンパクの分子サイズ、量、寿命のちがいから、少なくとも6つの群に分けられた。(2)比較的採取しやすいリンパ球、直腸粘膜を用いても、酵素活性、イムノブロットによる酵素診断が可能なことを確認した。(3)ヒトのT2cDNA.およびT2遺伝子のクロ-ニングを行った。この結果、T2cDNAの翻訳領域は227個のアミノ酸をコ-ドする1281個の塩基から成っていること、T2遺伝子は全長約2.7万塩基からなり、12個のエクソンを含んでいることがわかった。(4)患者のRNA発現を調べたところ(ノ-ザンブロット)、その発現量は患者によって差がみられ、RNA発現のレベルでも異質性のあることがわかった。(5)PCR法を用いて遺伝子解析を行ったところ、1例の患者において、一方のalleleではエクソン6内の点変異、他方のalleleではエクソン8のスキッピングからなるヘテロ接合体を明らかにした。(6)このエクソンスキップの原因はイントロン8の5'スプライスサイトにおける点変異であることも判明した。今後さらに患者および家族の解析を進め、本症の病因および遺伝的背景を明かにしてゆきたい。

Research Products

• [Publications] T.Fukao,S.Yamaguchi,H.Nagasawa,M.Kano,T.Orii,Y.Fujiki,T.Osumi,T.Hashimoto: "Molecular cloning of cDNA for human mitochondrial acetoacetylーCoA thiolase and molecular analysis of 3ーketothiolase deficiency" J.Inhrited Metabolic Disease. 13. 757-760 (1990)
• [Publications] T.Fukao,S.Yamaguchi,M.Kano,T.Orii,Y.Fujiki,T.Osumi,T.Hashimoto: "Molecular cloningand sequence of the complimentary DNA encoding human mitochondrial acetoacetylーCoA thiolase and study of the variant enzymes in cultured fibroblasts with 3ーketothiolasedeficiency" J.Clinical Investigation. 86. 2086-2092 (1990)
• [Publications] S.Yamaguchi,T.Orii,K.Maeda,M.Oshima,T.Hashimoto: "A new variant of glutaric aciduria type II:Deficiency of βーsubunit of electron transfer flavoprotein" J.Inherited Metabolic Disease. 13. 783-786 (1990)
• [Publications] S.Yamaguchi,T.Orii,Y.Suzuki,K.Maeda,M.Oshima,T.Hashimoto: "Newly identified forms of electron transfer flavoprotein deficiency in two patients with glutaric aciduria type II" Pediatric Research. 29. 60-63 (1991)
• [Publications] 長沢 宏幸,山口 清次,折居 忠夫,小林 正紀,和田 義郎,壱倉 圭子,嶋尾 智,岡田 敏夫: "グルタ-ル酸尿症I型(GlutarylーCoAdehydrogenase欠損症):本邦4症例と家族の酵素学的検索" 日本小児科学会雑誌,94:103ー108. 94. 103-108 (1990)
• [Publications] 清水 信雄,山口 清次,折居 忠夫: "ジカルボン酸尿症を認めた症例の有機酸プロフィ-ルの検討" 日本小児科学会雑誌. 94. 2023-2029 (1990)
• [Publications] Seiji Yamaguchi: "Prenatal Diagnosis and Neonatal Monitoring of a Fetus with Glutaric Aciduria type II Due to Electron Transfer Flavoprotein(Bーsubunit)Deficiency" Journal of Pediatrics.
• [Publications] Nobuo Shimizu: "Mass Spectronetric Analysis of Metabolite Excretion in Five Japanese Patients with the Late Onset Form Glutaric Aciduria Type II" Biological Mass Spectrometry.
• [Publications] S.Yamaguchi,T.Fukao,H.Nagasawa,T.Orii,N.Sakura.R.B.H.Schatgens,L.Sweetman,Y.Fujiki,T.Osumi,T.Hashimoto: "3ーketothiolase deficiency:molecular heterogeneity of the enzyme defect and cloning of the cDNA,Fatty Acid Oxidation:Clinical,Biochemical,and Molecular Aspects" Alan R.Liss,Inc.,New York, 728 (1990)
• [Publications] 山口 清次,清水 信雄,折居 忠夫: "尿中有機酸分析,小児の臨床検査指針,小児科診療増刊" 1 診断と治療社, 808 (1990)