1989 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト卵透明帯と抗原性を交叉するブタ卵透明帯抗原の遺伝子クロ-ニング
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01570944
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| Research Institution | Hyogo Medical University |
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Principal Investigator |
香山 浩二 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (00068496)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 則行 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (50174644)
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| Keywords | 卵透明帯 / 交叉抗原 / 遺伝子クロ-ニング |
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| Research Abstract |
ブタ卵よりGuanidinium/Hot phenol法によりRNAを抽出し、さらにOligo(dT)-Celluloseのアフィニティクロマトによりpoly(A)^+RAN5μgを鋳型にして、double stranded cDNAを合成し、両端にEco-RI linkerを付けた後、ゲル濾過により約500pp以上の長さを持つものを選択して、その約10ngをファ-ジベクタ-λ gt11(0.5μg)に組み込んだ。それをパッケ-ジングしてcDNAライブラリ-とした。得られたoriginal plaqueは2.5×10^5個であった。それをアンプリファイした後、プラ-ク約1.0×10^6個を抗体によるスクリ-ニングに供した。大腸菌Y1090を宿主として寒天プレ-ト上にプラ-クを形成させ、そこへIPTGを含んだニトロセルロ-スフィルタ-をのせ、フィルタ-上にcDNAに対するペプチドとβガラクトシダ-ゼとの融合タンパクを発現させた。フィルタ-はブタZP-4に対するモノクロ-ナル抗体5H4あるいは、精製したZP4に対する抗血清を使った蛍光抗体法により、スクリ-ニングを行なったが、抗体と反応する陽性プラ-クは得られなかった。今後新たにライブラリ-を作成し、再び単離を試みる予定である。
一方、可溶化ブタ卵透明帯より対応抗原を精製して、そのN末端20個のアミノ酸配列を決定した。さらにプロテア-ゼ処理により得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、polymerase chain reactionによりcDNAクロ-ニングに利用する予定である。
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