セファロスポリナ-ゼ型βーラクタマ-ゼ活性中心機能の研究

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01571194
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 澤井 哲夫 千葉大学, 薬学部, 教授 (70009174)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚本 喜久雄 千葉大学, 薬学部, 助手 (20183478)
• Keywords: βーラクタマ-ゼ / セファロスポリナ-ゼ / 活性中心 / βーラクタム抗生物質 / 薬剤耐性 / 部位特異的変異導入 / グラム陰性菌

Research Abstract

病原性グラム陰性細菌Citrobacter freundii GN346株の生産するセファロスポリナ-ゼ型βーラクタマ-ゼの活性中心において、Serー64が酵素ー基質(βーラクタム抗生剤)のアシル中間体を形成する触媒中心であり、Lysー67がアシル中間体形成に必須の役割を果たす重要な機能アミノ酸残基であることを前年度の研究により明らかにした。前年度に引き続きSerー64に近いGluー61、Asnー70を部位特異的変異導入により置換した変異酵素の酵素化学的特性を測定した。これらのアミノ酸残基は酵素触媒反応過程に直接的には関与しないが、これらの部位の変化は酵素の基質特異性に影響を与えることを確認した。次に、アミノ酸一次配列の明らかにされている他βーラクタマ-ゼとの比較から、βーラクタマ-ゼ間で保存性が特に高く3次元的にSerー64に近接し、活性中心構造を形成すると推測されるLysー315、Thrー316およびGlyー317を部位特異的変異導入によりそれぞれ種々のアミノ酸と置換した。これらの変異酵素の酵素化学的性質からLysー315が酵素反応に直接的に関与する重要残基であり、おそらく脱アシル化反応に関与することが明らかとなった。更に、基質と直接的接触作用の無い活性中心ポケットの淵に局在すると推測される酸性アミノ酸残基Aspー217、Gluー219の置換により基質特異性が著しく変化し、特に多くのβーラクタマ-ゼに安定なオキシ・イミノ系セフアロスポリン剤に対し高い分解活性を獲得することを発見した。この知見は自然界で今後発生する新規耐性菌の特性を予測させるものである。また、Tyrー150も触媒反応に直接関与する機能残基であることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] T.Tsukamoto: "Substitution of aspartic acidー217 of Citrobacter freundii cephalosporinase and properties of the mutant enzymes" FEBS Lett.246. 211-214 (1990)
• [Publications] T.Tsukamoto: "Extension of the substrate spectrum by an amino acid substitution at residue 219 in the Citrobacter freundii cephalosporinase" J.Bacteriol.172. 4348-4351 (1990)
• [Publications] T.Tsukamoto: "Function of the conserved triad residues in the class C βーlactamase from Citrobacter freundii GN346" FEBS Lett.271. 243-246 (1990)