ヒト胎盤由来抗凝固蛋白質(PAP)の構造と機能に関する研究

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01571219
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 船越 崇行 熊本大学, 薬学部, 助教授 (90150549)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 庄司 省三 熊本大学, 薬学部, 助教授 (60040317)
• Keywords: 血液凝固 / 抗凝固蛋白質 / ヒト胎盤 / Ca^<2+>依存性リン脂質結合蛋白質 / 作用部位 / 抗凝固ペプチド

Research Abstract

1.PAP分子中のCa^<2+>及びリン脂質結合部位ペプチドの分離:PAPをトリプシン、キモトリプシン及びエラスタ-ゼで限定分解した後、それぞれ、Waters HPLCシステム(μBondapack C18カラム)を用いて分離し、得られた個々のペプチドについて抗凝固作用を測定した。その結果、トリプシン分解で得られたペプチドに強い抗凝固活性を示すものが認められ、そのアミノ酸配列分析からPAP分子中Argー151からArgー244に最も高い活性が認められ、Glyー260からArgー275にも活性が認められた。
2.Ca^<2+>及びリン脂質結合部位(活性部位)ペプチドの合成:元年度で得られた知見、即ちPAPの抗凝固活性部位にHis残基が関与している点を考慮してPAP分子中のHis3残基周辺の配列を含むペプチド3種を合成し、その抗凝固活性を測定した。その結果、PAP分子中の204ー209残基及び266ー271残基に相当するペプチドSHLRKV及びDHTLIRには強い抗凝固活性が認められたが97ー102残基に相当するKHALKGには活性は認められなかった。また、前2者のHis残基をAla残基に置換したペプチドSALRKV及びDATLIRには全く活性が認められず、このことはPAP分子中のHisー205とHisー267残基がPAPの抗凝固活性に必須であり、Ca^<2+>またはリン脂質とPAPの結合にこれらの残基が深く関与しているものと推察された。
3.PAPの生体内分布及び細胞内局在:抗PAP単クロ-ン抗体(MoAbーPAP)をKo^^¨hler & Milstenの方法に従って調製し、これを用いてPAPの生体内分布をWestern blot法で、細胞内局在を間接蛍光抗体法を用いて検討した。その結果、PAPはヒト肝臓、腎臓、大腸中に検出され、血管内皮細胞を初め各種培養癌細胞中にも検出された。また、PAPの細胞内局在を結腸腺癌のWiDr(上皮性細胞)及びCOLO320DM(円形細胞)細胞を用いて検討したところ、共に膜近傍に局在することが判明した。

Research Products

• [Publications] 阿部 美子: "ヒト胎盤由来抗凝固蛋白質の作用部位 並びに細胞内局在" 生化学. 62. 682-682 (1990)
• [Publications] 阿部 美子: "ヒト胎盤由来抗凝固蛋白質の機能部位の検討" 生化学. 62. 1428-1428 (1990)
• [Publications] 船越 崇行: "Structure and Function of the Peptide Included in the Functional Site of Placental Anticoagulant Protein" The 28th Symposium on Peptide Chemistry. 28. 20-20 (1990)
• [Publications] 阪田 光彦: "Morphological Detection of Placental Anticogulant ProteinーI (PAPーI) in Human Placenta" Jpn.J.clin.Pathol.38. 1173-1175 (1990)
• [Publications] 船越 崇行: "Structure and Fuction of the Peptide Included in the Functional Site of Placental Anticoagulant Protein(PAP)" Peptide Chemistry. (1991)
• [Publications] 船越 崇行: Biochemistry International. (1991)