ガングリオシドにより活性調節されるタンパクリン酸化酵素の構造と機能の解析

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01580153
• Research Institution: University of Tokyo
• Principal Investigator: 辻 崇一 東京大学, 医学部, 助手 (90124677)
• Keywords: ガングリオシド / タンパクリン酸化 / 細胞表層 / 神経芽腫瘍細胞 / エクト型タンパクリン酸化酵素 / 神経突起伸展作用

Research Abstract

ectoー型のガングリオシド依存性タンパクリン酸化系を作年度に引き続きさらに詳細に検討すべく、GOTO細胞の形質膜画分を調製し、その画分中のタンパクリン酸化活性を調べると細胞表層で見られるectoー型の酵素活性と同等と考えられる活性をある程度再現出来るが、GQlb依存性はどうしても見られなくなってしまった。これは、in vitro活性測定法が未だ十分には確立されていないためと考えられる。今後、さらに検討が必要である。
本年度は、ラット脳の膜画分におけるガングリオシド依存性タンパクリン酸化系を重点的に解析した。ヒト由来の神経芽腫瘍細胞に見られた低濃度ガングリオシドGQlbにより活性化されるタンパクリン酸化系と同様の系が、ラット脳の膜画分にも存在していることが明らかとなった。10^<ー8>M濃度のガングリオシドGQlbによりリン酸化が昂進する基質が、SDSーPAGEで見る限り、少なくとも二つ存在している。このガングリオシド依存性のリン酸化は基質特異性が極めて高い。そのうちの分子量72KDaの基質を可溶化する様々な条件を検討した。その結果、NPー40が安定かつ高収率で基質を可溶化できることが明らかとなった。イオン交換、疎水性クロマトグラフィ-などにより、可溶化された基質を単離精製する条件を組織的に検討した。その結果、SDSーPAGEで見る限りほぼ単一なスポットを与えるまで精製することができた。今後、その部分一次構造の解析を行ない、それをもとに基質タンパク質72KDaのクロ-ニングを行なう予定である。さらに、この基質を大量に調製し、それを用いて、酵素側の検討を進める予定である。

Research Products

• [Publications] Hideki Yamamoto: "Tetrasialoganglioside GQlb reactive monoclonal antibodies:their characterization and application for quantification of GQlb in some cell lines of neuronal and adrenal origin(s)." J.Neurochem.54. 513-517 (1990)
• [Publications] Shuichi Tsuji: "Minireview: gangliosides as modulators of cell to cell interactions." Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2. 253-262 (1990)
• [Publications] 辻 崇一: "神経成長栄養因子としてのガングリオシド" 神経研究の進歩. 34. 598-611 (1990)
• [Publications] 辻 崇一: "神経系のガングリオシド" 蛋白質核酸酵素(別冊神経生化学). 35. 535-545 (1990)
• [Publications] 辻 崇一: "細胞間情報伝達に関与するガングリオシド" 医学のあゆみ. 154. 463-466 (1990)
• [Publications] 辻 崇一: "スフィンゴ脂質ならびにその代謝産物と情報伝達" 医学のあゆみ. 155. 608 (1990)
• [Publications] Tatsuro Yamashita: "Sialyl choleserol is translocated into cell nuclei and it promotes neurite outgrowth in a mouse neuroblastoma cell line." Glycobiology. 1. (1991)
• [Publications] Kazuhiko Mitsui: "Multiple neurites formation in neuroblastoma cells by griseoric acid,a potent inhibitor of cyclic nucleotide phosphodiesterase." J.Neurochem.57. (1991)
• [Publications] Shuichi Tsuji: "Gangliosides as modulators of protein kinases." Neurochem.Int.
• [Publications] Hideki Yamamoto: "Establishment of a monoclonal antibody directed to the minor novel gangliosides in bovine brain and cultured neural cell lines." Brain Res.
• [Publications] Takashi Nakaoka: "Biーmodal regulation of protein phosphorylation by gangliosides in rat brain membrane." J.Neurochem.
• [Publications] Shuichi Tsuji: "A novel glycosignaling systems:GQlbーdependent neuritoーgenesis of human neuroblastoma cell line,GOTO,is by way of GQlbーdependent ectoーtype protein phosphorylation." J.Biochem.
• [Publications] Tatsuro Yamashita: "Sialyl cholesterolーdependent neuritogenesis requires transcriptional perturbation." Glycobiology.
• [Publications] Yoshitaka Nagai: "Roles of glycosignals in cell membranes." Biochim.Biophys.Acta.
• [Publications] Tatsuro Yamashita: "Amphipatic compounds containing sialic acid dependent neurotigenesis on the neuroblastoma cell line,Neuro2a: effects of serum." J.Neurochem.
• [Publications] 辻 崇一: "ガングリオシドが関与する細胞間情報伝達" メビオ. 8. 130-131 (1991)
• [Publications] 辻 崇一: "GOTO" 蛋白質核酸酵素. 36. (1991)
• [Publications] 辻 崇一: "老年期痴呆ーー神経組織障害の修復(宮武正編)#神経系における細胞間認織因子および増殖・分化調節因子としての糖脂質.PP・110ー132" 科学評論社, 186 (1990)
• [Publications] Shuichi Tsuji: "“Adenosine and Adenine Nucleotides"ed by S.Imai #ATP and glycoーsignals for the activation of ectoーprotein kinases in neuronal cells.(in press)" Elsevier,Amsterdam., (1991)