軟骨由来成長因子(CDF)及びその前駆体の単離・同定

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01580163
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 開 祐司 大阪大学, 歯学部, 助手 (40144498)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 不二男 大阪大学, 歯学部, 教授 (40028717)
• Keywords: 軟骨由来成長因子 / cDNAクロ-ニング / 精製 / アミノ酸配列 / 軟骨細胞 / 細胞分化 / プロテオグリカン合成

Research Abstract

ウシ胎児軟骨組織抽出物中には培養軟骨細胞の増殖及び分化機能の発現を促進する蛋白質性の因子(CDF)が存在する。また、CDFは、互いに分子量のことなる複数の蛋白質として存在することが判明している。そこで、本年度は軟骨に含まれるすべてのCDF活性物質の完全精製を目指して、大量の新鮮なウシ胎児軟骨組織の採集から研究を開始した。その結果、約7kgの軟骨組織を確保することが出来た。これをIMグアニジン塩酸(pH6.0)にて抽出した後、アセトン分画(45ー60%)した。さらに、限外濾過により分子量1万から5万の画分を得た。ウサギ肋軟骨細胞培養系を用いた生物検定の結果、本画分に強いCDF活性を検出した。次に、ヘパリンセファロ-スカラムにかけ0.5Mー1.2MNaClで溶出される画分に全てのCDF活性が回収されていることを確認した。さらに、陽イオン交換クロマトグラフィ-により溶出される活性画分を0.1%トリフロロ酢酸に溶解して逆相クロマトグラフィ-を行なったところ、分子量16kDaを示す活性物質(16kCDF)を単離することに成功した。そこで、気相シ-クエンサ-により16kCDFと思われる蛋白質のN末端21残基のアミノ酸配列を明らかにした(ただし、7番目と12番目のアミノ酸残基は不明であった)。そこで、ウシ胎児肋軟骨組織から常法によりRNAを単離してcDNAを調整した。先に決定した16kCDFのN末端21残基のアミノ酸配列の内、N末端側とC末端側のアミノ酸配列順序から想定される DNAを合成し、これをプライマ-として先に調整したcDNAからPCR(polymerase chain reaction)法により16kCDFのN末端部分をコ-ドするcDNA断片を同定することに成功した。この結果、16kCDFのN末端21残基の全アミノ酸配列が明かとなった。現在、他のCDF分子種の精製と今回得られたcDNA断片を利用して16kCDFの全長cDNAのクロ-ニングを行なっている。

Research Products

• [Publications] H.Inoue,Y.Kato,M.Iwamoto,Y.Hiraki,M.Sakuda,F.Suzuki: "Stimulation of cartilageーmatrix proteglycan synthesis by morphologically transforamed chondrocytes grown in the presence of fibroblast growth factor and transforming growth factorーbeta" J.Cell.Physiol. 138. 329-337 (1989)
• [Publications] Y.Hiraki,H.Inoue,A.Asada,F.Suzuki: "Differential modulation of growth and phenotypic expression of chondrocytes in sparse and confluent culutures by growth factors in cartilage" J.Bone Mineral Res. (1990)