Ca^<2+>・燐脂質依存性蛋白質燐酸化酵素(Cキナ-ゼ)の基質認識について

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01641513
• Research Institution: 福井医科大学
• Principal Investigator: 山村 博平 福井医科大学, 医学部, 教授 (90030882)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 幸枝 福井医科大学, 医学部, 教務職員 (10197486) ; 谷口 隆信 福井医科大学, 医学部, 助手 (60217130) ; 箸本 英吉 福井医科大学, 医学部, 助教授 (20116239)
• Keywords: Cキナ-ゼ / 限定分解 / トリプシン様プロテア-ゼ / イオン強度 / pH / ヒストキナ-ゼ

Research Abstract

私共は、肝細胞膜を種々のイオン強度下(0〜210mMNaCl)でインキュベイトすると内因性トリプシン様プロテア-ゼの作用によりある種のヒストンキナ-ゼの活性化が認められることを見い出した。この肝細胞膜におけるプロテインキナ-ゼの活性化機構をさらに解析したところ反応溶液のpHもまた重要な因子であることを見いだした。即ちこのヒストンキナ-ゼのプロテア-ゼによる活性化速度は生理的な条件よりやや高いイオン強度(140〜210mMNaCl)とアルカリ側のpH(7.5〜8.0)のもとで最も早く、この2つの因子の効果はほぼ相加的である。そこでこの活性化されて膜から遊離した酵素を種々のクロマトグラフィ-で約500倍精製しその性質を検討した。本酵素はゲルロカ法で分子量約5万のセリンキナ-ゼで小牛胸線の全ヒストン、H_2Bヒストン、プロタミンの燐酸化ではその最大活性に高Mg^<2+>の存在(75mM)を必要とする。cAMP、Ca^<2+>、燐脂質、ヂアシルグリセロ-ル、カルモジュリンなど種々のプロテインキナ-ゼの活性調節因子は本酵素の活性に影響を与えないがH-7によって阻害されそのKiは6μMである。また燐酸化ヒストンのトリプシン消化ペプチドをHPLCで解析したところその燐酸化ペプチドの溶出パタ-ンはラット脳のCキナ-ゼを限定消化してえた活性化酵素を用いた場合と一致する。これらの特徴はいずれも膜に結合したCキナ-ゼが限定消化を受け活性化されたことを示唆しているが、この点はウエスタンブロット法でも確認された。この反応に関与するCキナ-ゼの分子種はタイプIIIの酵素であった。これらの結果は、肝臓のタイプIIIに属するCキナ-ゼが膜周辺のイオン強度とpHの変化に対応してトリプシン様プロテア-ゼによって限定分解を受け活性化されることを示しており、本酵素のダウンレギュレイションや細胞膜のNa^+/H^+交換輸送形の活性化との共役などの点からも興味深い現象である。

Research Products

• [Publications] Kobayashi Tomoko: "Cytosolic protein-tyrosine kinase activities in various rat tissue." Annals Clin.Biochem.26. 164-169 (1989)
• [Publications] Sakai Keiko: "Effect of poly-basic amino acids on the phosphorylation of various substrate proteins by cytosolic protein-tyrosine kinase from porcine spleen" Biochem.Biophys.Res.Commun.158(3). 1043-1049 (1989)
• [Publications] Nakamura Shun-ichi: "Thrombin and collagen induce rapid phosphorylation of a common set of cellular protein on tyrosine in human platelets." J.Biol.Chem. 264. 7089-7091 (1989)
• [Publications] Hashimoto Eikichi: "Ionic strengthーdependent interaction of rat liver casein kinase I." Biochem.Biophys.Res.Commun.160(2). 633-637 (1989)
• [Publications] Kawata Masahito: "Phosphrylation of smg p21-like GTP-binding protein,by cyclic AMP-dependent protein kinase in a cell-free system and in response to prostaglandin El in intact human platelets." J.Biol.Chem.264(26). 15688-15695 (1989)
• [Publications] Hashimoto Eikichi: "Further studies on the ionic strenghth-dependent proteolytic activation of protein kinase C in rat liver plasma membrane by endogenous trypsin-like proteasee." J.Biochem.160(6). 1041-1048 (1989)
• [Publications] Sakai Keiko: "Phospholipids differently modulate the activity of cytosolic protein-tyroshine kinase from porcine spleen" Biochem.Biophys.Res.Commun.165. 680-684 (1989)
• [Publications] Hashimoto Eikichi: "Comparison of substrate recognition by protein kinase(typeIII)between rat liver cytosolic and particulate fractions." Int.J.Biochem.
• [Publications] Kobayashi Tomoko: "Purification and characterization of a cytosolic protein-tyrosine kinase from porcine spleen." Eur.J.Biochem.
• [Publications] Asahi Momoyo: "Divese effects of poly-basic amino acids,heparin and ionic strength on the phosphorylation of various substratesby cytosolic protein-tyrosine kinase from porcine spleen." Int.J.Biochem.
• [Publications] Hashimoto Eikichi: "Mechanism of proteolytic activation of rat liver protein kinase C generating Ca^<2+> phospholipid-independent form with apparent molecular mass of 80,000" Int.J.Biochem.
• [Publications] 小林智子: "羊土社" 実験医学, 7 (1989)
• [Publications] 谷口隆信: "代謝" 中山書店, 9 (1990)