G蛋白質と連関した神経伝達物質受容体の精製法の開発

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01870003
• Research Institution: University of Tokyo, Faculty of Medicine
• Principal Investigator: 芳賀 達也 東京大学, 医学部(医), 教授 (30011646)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 町田 肇 三菱化成(株), 総合研究所, 主任研究員 ; 野口 康二 旭化成(株), GS開発室長, 室長 ; 石田 寅夫 旭化成(株), ライフサイエンス総合研究所, 所長
• Keywords: G蛋白質 / アセチルコリン受容体 / ムスカリン受容体 / 蛋白質精製法 / アフィニティ-クロマトグラフィ- / レセプタ- / GTP結合蛋白質 / バキュロウイルス

Research Abstract

(1)庶糖エステル(Sucrose monolaurate,SM-1200)を用いて、ブタ心房膜標品またはヒトm2サブタイプを発現させた昆虫細胞からムスカリン受容体をリガント結合活性を維持して約50%可溶化できることが分った。(2)SM-1200での可溶化標品から、同一溶媒中でのアフィニティ-クロマトグラフィ-操作で、ムスカリン受容体を約1000倍精製できた。精製した受容体はG蛋白質と相互作用する活性を維持していた。(3)心房膜標品にG蛋白質を取込ませ、そこからムスカリン受容体・G蛋白質複合体を可溶化することを試みた。複合体の指標としてグアニンヌクレオチド感受性高親和性アゴニスト結合を用いた。調べた13種の界面活性剤の中では、SM-1200を用いたとき最も高いGTP感受性高親和性アゴニスト結合が可溶化上清に見い出された。(4)SM-1200で可溶化したムスカリン受容体と可溶化・精製したG蛋白質をSM-1200溶液中で混ぜ合わせると、GTP感受性高親和性アゴニスト結合が観察された。この結果は溶液中で受容体とG蛋白質の複合体が生成可能であることを示唆する。(5)G蛋白質βγサブユニットを結合させたアガロ-スゲルを作成した。このゲルには、Gi、Go及びGqのαサブユニットが結合した。しかし、このゲルにSM-1200で可容化した受容体を結合させる試みは成功していない。(6)G蛋白質αβγ3量体を結合させたゲルに、SM-1200で可溶化した受容体を結合させる試みを行なった。GTP感受性の結合が観察されたが、その収量は1%以下であった。(7)G蛋白質βγサブユニット、Go-α、Gi-α、Gq-αなどに対するポリクロ-ナル及びモノクロ-ン抗体を作成した。Go-αに対する抗体は、Go-αの精製に使用可能であったが、SM-1200で可溶化した受容体・G蛋白質複合体を可容化する試みは成功しなかった。(5)-(7)については、さらに条件を検討中である。

Research Products

• [Publications] M.Kajimura: "Carbachol-induced potentiation and inhibition of acid secretion by guinea pig gastric glands." Eur.J.Pharmacol.178. 59-69 (1990)
• [Publications] F.Nakamura: "Identification of two novel GTP-binding protein a-subunits that lack apparent ADP-ribsylation sites for pertussis toxin." J.Biol.Chem.266. 12676-12681 (1991)
• [Publications] K.Haga: "Activation by G protein bg subunits of agonist- or light-dependent phosphorylation of muscarinic acetylcholine receptors and rhodopsin." J.Biol.Chem.263. 2222-2227 (1992)
• [Publications] K.Shiozaki: "Effects of magnesium ion on the interaction of atrial muscarinic acetylcholine receptors and GTP-binding regulatory proteins."
• [Publications] A.Rinken: "Solubilization and purification of muscarinic acetylcholine receptors in sucrose monolaurate."
• [Publications] A.Rinken and T.Haga: "Interaction of muscarinic acetylcholine receptors and GTP-binding regulatory proteins in solution."