レ-ザ-光散乱法を用いた細胞内カルシウム動態調節蛋白質の高次構造・機能連関解析

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01870107
• Research Institution: Osaka University School of Medicine
• Principal Investigator: 多田 道彦 大阪大学, 医学部, 教授 (90093434)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 乾 誠 大阪大学, 医学部, 助手 (70223237) ; 星田 四朗 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 ; 葛谷 恒彦 大阪大学, 医学部, 助手 (80150340)
• Keywords: Ca輸送ATPase / 筋収縮 / レ-ザ-光散乱 / 蛋白質間相互作用 / 能動輸送 / カルシウムイオン / 可溶化 / 膜蛋白質

Research Abstract

筋肉の収縮・弛緩に伴う細胞内Ca濃度の調節において、筋小胞体CaポンプATPaseは、中心的な役割を担っている。ATPase蛋白質はは、膜内で多量体構造をとることが示唆されており、その分子間相互作用が機能発現に重要と考えられている。本研究の目的は、可溶化膜蛋白質の分子量決定に有効な低角レ-ザ-光散乱法をさらに発展させ、膜蛋白質の多量体構造と酵素活性・リガンド結合能などの機能的側面の関係を同時に解析できるシステムを開発せんとするものである。
1、<膜蛋白質分子量測定システムの開発>___ー:昨年度、ゲル濾過カラムに低角レ-ザ-光散乱計を示差屈析計・紫外吸光度計とともに接続することにより、可溶化膜蛋白質の分子量測定システムを確立した。本年度は、本システムを可溶化した筋小胞体CaポンプATPaseに応用し、monomer分子量=109000±6300(n=3)の値を得た。これは既に知られている筋小胞体CaポンプATPaseの一次構造のアミノ酸配列から計算されたmonomer分子量の理論値110331と一致した。
2、<筋小胞体CaポンプATPaseの酵素活性・分子量同時測定、およびATP加水分解に共役した高次構造変化:>___ー:昨年度、上記システムを応用し、可溶化ATPaseの酵素活性と分子量との同時評価を可能にした。ATP非存在下では可溶化ATPaseはmonomerとdimerに分離して溶出するが、ATP添加により両成分が融合し、ATP加水分解に共役した両成分の速い相互変換が示唆された。本年度はさらに、筋小胞体CaポンプATPaseの活性サイクルの中で、いかなる段階にmonomer,dimer間の相互変換が起きるかについて検討した。Ca結合型のE_1およびE_1P状態ではmonomer,dimer間の相互変換は起きず、両成分は分離して溶出した。これから、両成分の相互変換はCa非結合型のE_2,E_2P状態ないしE1→E2,E2→E1の状態変換時に起きることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Inui,M.et al: "Molecular mechanism of calcium uptake and release by cardiac sarcoplasmic reticulum" Jpn.Circ.J.34. 1185-1191 (1990)
• [Publications] Kijima,Y et al: "ProteinーProtein interaction of detergentーsolubilized Ca^<2+>ーATPase During ATP hydrolysis analyzed by lowーangle laser light scattering photometry coupled with highーperformance gel chromatography" Biochim.Biophys.Acta. 264. 12950-12955 (1989)
• [Publications] 多田 道彦,他: "心筋小胞体カルシウムシグナリング蛋白質" 蛋白質・核酸・酵素. 35. 1705-1714 (1990)