1990 Fiscal Year Annual Research Report
時間分解法と新しい蛍光試薬に基づく超高感度蛍光顕微鏡の開発と応用
| Project/Area Number |
01880030
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
楠見 明弘 東京大学, 教養学部, 助教授 (50169992)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内藤 正幸 オリンパス, 機器グループ, 主任研究員
辻 明彦 浜松ホトニクス, 研究部, 研究員
馬渕 一誠 東京大学, 教養学部, 助教授 (40012520)
山口 和夫 神奈川大学, 理学部, 講師 (20114902)
|
|---|
| Keywords | 蛍光顕微鏡 / 蛍光寿命 / 画像処理 / 蛍光試薬 / 共鳴エネルギ-移動 / エンドソ-ム |
|---|
| Research Abstract |
時間分解蛍光顕微鏡装置の組み上げを行い、装置の基本性能を確かめた。なお、励起パルスの周波数を当初に計画した200Hzから400kHzに上昇させることによって、パルス当りのエネルギ-を減少させ、試料に与える影響の減少を図ることにした。このため、レ-ザ-をエキシマ-レ-ザ-からモ-ドロック・キャビティ-ダンプのアルゴンレ-ザ-に変更した。それに伴い、励起波長が488nmまたは514.5nmとなるため、試料の劣化がさらに抑えられる。
装置の応用法の一つとして、蛍光寿命イメ-ジング法を開発した。この方法は、同一視野で、励起レ-ザ-光照射からゲ-トを開けるまでの遅延時間を変化させて数枚の画像を撮り、画像処理計算することにより、顕微鏡の視野内の各点で蛍光寿命を同時測定し(空間分解能0.2μm)、寿命の大小をコントラストとする画像を得るものである。蛍光寿命から蛍光共鳴エネルギ-移動を測定して(蛍光寿命が共鳴エネルギ-移動が起こると短くなる)蛋白質の集合や会合を検出することができる。種々の蛍光寿命をもつ蛍光色素で標識したリポソ-ムによるモデル実験を行い、7.8nsecおよび5nsecの蛍光寿命を持つリポソ-ムを画像として区別することができた。現在は生体膜研究への応用として、培養細胞中でのエンドソ-ム間の膜融合の測定を行っている。
新しい蛍光色素の開発として、pyene環をアンテナとし、EDTAをキレ-ト部とするpyreneーEDTAを合成し、試験中であるほかに、数種類の蛍光試薬を合成中である。また、種々のテルビウム・ユ-ロピウム試薬を検討した結果、thenoyl trifluoroacetone等βージケトン形のアンテナ部位を持つユ-ロピウム試薬を用いた2光子励起法を開発することとした。
|
-
[Publications] W.K.Subczynski,W.E.Antholine,J.S.Hyde,and A.Kusumi: "Microimmiscibilty and threeーdimensional structure of unsaturated phosphatidylcholineーcholesterol membranes:fluid phase separation in unsaturatedーphosphatidylcholineーcholesterol membranes." Bio chemistry. 29. 7936-7945 (1990)
-
[Publications] A.Kusumi,A.Tsuji,M.Murata,Y.Sako,S.Kagiwada and S Ohnishi: "Development of timeーresolved microfluorimetry and its application to cellular membrans." Timeーresolved laser spectroscopy in biochemistry II SPIE proceedings 1204(J.R.Lakowicz.Ed.). 1204. 776-783 (1990)
-
[Publications] M.PasenkiemiczーGierula,W.K.Subczynski and A.Kusumi.: "Rotational diffusion of a steroid molecule in Phosphatidylcholineーcholesterol membrans:fluid phase separation in unsaturatedーphosphatidylchaliveーcholesterol membranes." Bio chemistry. 29. 4059-4069 (1990)
