動物細胞、分裂酵母菌を宿主にしたcDNA発現クロ-ニングシステムの開発

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01890009
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岡山 博人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40111950)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小野 泰子 大阪大学, 微生物病研究所, 教務員 (70194602) ; 永田 昭久 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (50155933) ; 野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)
• Keywords: cDNA / 発現クロ-ニング / Schizosaccharomyces pombe / 動物細胞 / 遺伝子相補 / 酵母ベクタ- / 酵母トランスフェクション法

Research Abstract

本年度の実施計画通り、高効率酵母トランスフェクション法、cDNAバンク導入と回収を容易にする高効率酵母ベクタ-、少量のmRNAから非常に大きなcDNAバンクが作れる高効率大腸菌コンピ-テント細胞作製法を完成した。これらの手法と、従来我々が開発してきた、高効率完全長cDNAバンク作製法、cDNA発現ベクタ-、cDNAバンク導入法と統合し、世界で初めて動物細胞と分裂酵母菌を同時に宿主とできるcDNA発現クロ-ニングシステムを完成した。高効率酵母トランスフェクション法は、リチュウム酢酸法の変法で、従来の方法より50〜100倍程効率が高く、1μgのDNA当り100万個のコロニ-が得られる。従って、酵母変異株の遺伝子相補を用いて、数百万個に一つしかない程、少量のcDNAクロ-ンも容易に単離できる。cDNAクロ-ンが安定に維持され、なお高い効率でcDNAバンクを酵母に導入できるベクタ-は、分裂酵母のARS配列、ura及びleu遺伝子とpBR322から成る。高効率大腸菌コンピ-テント細胞作製法は、従来のカルシウム法の変法であるが、1μgのDNA当り10億個以上のコロニ-が得られ、エレクトロポ-レ-ション法と比較し、効率では大差ないものの、かなりの高い塩濃度でも働き、細胞を凍結保存できるという利点を持つ(特許出願準備中)。従って、数μgのmRNAより数千万個のクロ-ンからなるcDNAバンクを作成することが可能となった。
このクロ-ンニングシステムを用いて、細胞周期遺伝子cdc25に相当するヒト遺伝子、wee1,pat1,cdc13変異株を相補するヒト遺伝子の単離に成功している。
今後、このクロ-ニングシステムを用いて、従来、単離が不可能であった多くの遺伝子が単離されると期待される。

Research Products

• [Publications] Hiroto Okayama: "Efficient vector system for cloning mammalian cDNA by transcomplentation of Schizosaccharomyces pombe:isolation of human cDNAs that complement patl." Mol.Cell.Biol.in press.
• [Publications] Hiroto Okayama: "High efficiency calcium phosphate transfection of mammalian cells." Current Protocols. in press.
• [Publications] Hiroto Okayama: "An improved method for high-efficiency transformation of Echerichiacoli with plasmids."