1992 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子改変収縮蛋白を用いた分子超微細構造に基づく筋収縮機構の研究
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02102009
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
若林 健之 東京大学, 理学部, 教授 (90011717)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須藤 和夫 東京大学, 教養学部, 助教授 (20111453)
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| Keywords | 筋収縮機構 / 筋収縮蛋白 / アクチン / ミオシン / 生物物理学 / 三次元像再開成 / 超微細構造 / 蛋白質工学 |
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| Research Abstract |
長年捜し求められていたミオシン分子のATPによる構造変化をシンクロトロン放射X線小角散乱により、ついに捉えることに成功した:ミオシン分子のATPによる構造変化は、筋収縮の分子的過程の最も重要なものであり、多くのグループにより追求されてきたが、この変化を捉える事は出来なかった。我々は若林克三博士のグループと協力し、高速液クロにより精製した新鮮で純粋なミオシン頭部を用い、シンクロトロン放射X線小角散乱法により、ATPによって構造変化が生じることを突き止めることに成功した。部位特異的重原子標識電子顕微鏡法のためにディクチオ型粘菌のミオシン遺伝子に部位特異的変異を導入しディクチオ型粘菌で発現させたが、
収量に問題があった。発現量を増す目的で、重鎖のC端部分を削り取りとった結果、数mgの変異ミオシンを精製できた。このミオシンはATP分解活性やアクチン結合能は保たれており、アクチンとの複合体の三次元再構成も可能であった。時間分解能電子顕微鏡法の開発が完成して、ケージドATPからのATP放出後、5ミリ秒から200ミリ秒のクライオ電子顕微鏡像を得ることに成功した。この時間分解電子顕微鏡像シリーズを解析して、ATPによるミオシンのアクチン・フィラメントからの離脱速度を単頭であるミオシンS1と双頭のHMMとで比較し、後者がより遅いことを確かめた。蛋白の電子顕微鏡法では、低電子線量での低雑音画像記録が重要
である。イメージング・プレートを用いてトロポミオシン準結晶の電子顕微鏡像を1000電子/nm^2で記録し、非子午線情報も取り込んで雑音濾過し、トロポミオシンの一分子像を得ることに初めて成功した。トロポミオシン分子の電荷を持った部位のみを重原子染色したところ、X線結晶解析からの予測と良く一致する結果を得た。
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[Publications] K.Wakabayashi et al.: "Small-angle Synchrotron X-ray Scattering Reveals Distinct Shape Change of the Myosin Head During Hydrolysis of ATP" Science. 258. 443-447 (1992)
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[Publications] A.Yamada & Y.Wakabayashi: "Movement of actin away from the center of reconstituted rabbit myosin filament is slower than in the opposite direction" Biophysical J.(1993)
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[Publications] K.Wakabayashi et al.: "Shape Change of Myosin Head induced by MgATP,studied by small-angle Synchrotron X-ray scattering in solution" J.Mucsle Res.Cell Motil.13. 481-481 (1992)
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[Publications] N.C.J.Strynadka et al.: "Molecular structure of the acyl-enzyme intermediate in β-lactam hydrolysis at 1.7 A resolution" Nature. 359. 700-705 (1992)
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[Publications] M.Hirono et al.: "Expression of Tetrahymena actin gene and chimeric actin genes in Dictyosterium cells" J.Muscle Res.Cell Motil.13. 483-484 (1992)
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[Publications] K.Sutoh: "Site-directed mutagenesis of Dictyosterium actin" J.Muscle Res.Cell Motil.13. 484-484 (1992)
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[Publications] M.Johara et al.: "Charge-reversion mutagenesis of Dictyostelium actin to map the surface recognized by myosin during ATP-driven sliding motion" Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(in press).
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[Publications] M.Hirono et al.: "A chimeric actin carrying N-terninal portion of Tetrahymena actin does not find to DNaseI" Biochem.Biophys.Res.Commun.184. 1511-1516 (1992)
