硝酸塩誘導型チトクロムPー450の機能解明と遺伝子のクロ-ニング

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02217203
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 祥雲 弘文 筑波大学, 応用生物化学系, 助教授 (70012036)
• Keywords: チトクロムPー450 / 脱窒 / フサリウム / 亜硝酸塩還元酵素

Research Abstract

1.不完全菌<Fusarium>___ー <oxysporum>___ーに、真核生物として初めて脱窒能が見出されたが、この脱窒系における重要なステップに関よる酵素,亜硝酸塩還元酵素活性を無細胞系で再構成することに成功した。活性を含む菌体抽出液より各成分を精製あるいは部分精製し、NADHーフェナジンメトサルフェ-ト(PMS)系を電子供与体とした再構成実験により各成分の機能を調べた。その結果、非分画抽出液中に検出される脱窒活性、すなわち亜硝酸塩から亜酸化窒素(N_2O)を生成する活性は、中間体として一酸化窒素(NO)を形成していることが確認された。さらに前半の亜硝酸塩還元酵素(NiR)と後半の一酸化窒素還元酵素(NOR)の両活性の分離に成功した。硝酸塩誘導型チトクロムPー450(Pー450dNIR)は後半のNOR活性に関与することが示された。このように、ユニ-クなカビの脱窒系が分子レベルで明らかにされつつあり、近い将来にその全体像が解明されであろう。
2.Pー450dNIRの抗体を用い、mRNAからcDNAを取得することに成功した。その塩基配列から予想されるアミノ酸一次配列は、P450として極めてユニ-クな特徴を示した。他のP450との相同性の比較から、Pー450dNIRは真核生物より原核生物(細菌)のP450に近く、進化の系統樹においても例外的に細菌のグル-プに分類された。さらに真核生物にみられるN末付近の疎水領域やプロの配列も存在せず、予想通り本P450が真核生物として初めての可溶性P450であることが示された。これらの性質やその機能はP450として前例が無く、構造.機能.進化などの諸点において極めて興味深い課題を示した。本Pー450はこの分野で大いに注目されつつある。

Research Products

• [Publications] 木澤 秀樹: "Nucleotide sequence of the unique nitrate/nitriteーinducible cytochrome Pー450 cDNA from <Fusarium>___ー <oxysporum>___ー" the Journal of Bilogical Chemistry. 226. (1991)
• [Publications] 谷本 達夫: "Components of the unique fungal denitrifying system of <Fusarium>___ー <oxysporum>___ー" the Journal of Biological Chemistry.