1990 Fiscal Year Annual Research Report
新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼの分子性状と構造・機能相関の解析
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02453150
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高橋 健治 東京大学, 理学部, 教授 (70011533)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丹治 雅夫 東京大学, 理学部, 特別研究員(PD) (50212048)
井上 英史 東京大学, 理学部, 助手 (20184765)
高橋 孝行 東京大学, 理学部, 講師 (80197152)
田之倉 優 東京大学, 理学部, 講師 (60136786)
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| Keywords | カルボキシルプロテア-ゼ / X線結晶解析 / NMR / 遺伝子 / トランスポゾンプロテア-ゼ / 粘菌プロテア-ゼ / カテプシンE / ペプシノ-ゲン |
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| Research Abstract |
1.<Aspergillus>___ー <niger>___ーの産生する新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼ(以下プロクタ-ゼA)の完全一次構造決定を完了し、39残基の軽鎖と173残基の重鎖が非共有結合的に結合していることを示すとともに、その遺伝子およびcDNAをクロ-ニングし、塩基配列決定により前駆体の一次構造を推定した。これにより、本酵素は282残基の一本鎖として生合成されることが明らかになった。また、本前駆体蛋白質を大腸菌で発現させることに成功した。
2.プロクタ-ゼの結晶化に成功し、X線結晶解析を行なった結果、解像度1.5A^^°以下の高分解解析像を得た。また、二次元NMR法および、CDスペクトル分析から、本酵素はβ構造を多く含み、水溶液中では会合せず、分子中に堅固なコア構造を有することが判明した。
3.プロクタ-ゼのpH変性過程をCD,NMRおよびゲルろ過法で解析し、pH6〜7の狭いpH域で、高次構造の大きな変化と両ペプチド鎖の解離を伴い、急速かつ不可逆的に失活することを明らかにした。
4.ショウジョウバエトランスポゾンプロテア-ゼ遺伝子を大腸菌で発現させ,活性酵素を得ることに成功し、性状検索を行なった。
5.粘菌(<Physarum>___ー <polycephalum>___ー)の菌体内より分子量約54,000の新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼを精製し、ペプスタチン非感受性であること,新規な基質特異性を有すること等を明らかにした。
6.ヒト胃カテプシンEを精製し、2種のアイソザイムの存在を示すとともに、糖鎖結合部位を同定した。また、プロカテプシンEが自己融媒的にカテプシンEに変換することを示した。また、蛋白化学的に初めてプロカテプシンEのN末端域構造を明らかにした。
7.カエル食道ペプシノ-ゲンを精製し、諸性状,N末端域一次構造、活性化機構等を明らかにし、C型ペプシノ-ゲンに属することを示した。
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[Publications] S.B.P.Athauda: "Structural evidence for two isozymic forms and the carbohydrate attachment site of human gastric cathepsin E" Biochemical and Biophysical Research Communications. 168. 878-885 (1990)
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[Publications] K.Murakami,Murofushi: "Purification and Characterization of a novel intracellular acid proteinase from the plasmodia of a true slime mold,<Physarum>___ー <polycephalum>___ー" Journal of Biological Chemistry. 265. 19898-19903 (1990)
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[Publications] M.Ichinose: "Hydrocortisoneーinduced enhancement of expression and changes in methylation of pepsinogen genes in stomach mucosa of the developing rat" Biochemical Biophysical Research Communications. 172. 1086-1093 (1990)
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[Publications] S.B.P.Athauda: "Autocatalytic processing of procathepsin E to cathepsin E and their structural differences" Biochemical Biophysical Research Communications. (1991)
