1991 Fiscal Year Annual Research Report
新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼの分子性状と構造・機能相関の研究
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02453150
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高橋 健治 東京大学, 理学部, 教授 (70011533)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 英史 東京大学, 理学部, 助手 (20184765)
高橋 孝行 東京大学, 理学部, 講師 (80197152)
田之倉 優 東京大学, 理学部, 講師 (60136786)
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| Keywords | カルボキシルプロテア-ゼ / 酸性プロテア-ゼ / 水溶性カルボジイミド / 基質特異性 / カテプシンE / cDNA / 自己触媒的活性化 / プロテア-ゼ前駆体 |
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| Research Abstract |
1.Aspergillus niger(クロコウジカビ)の産生する新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼについて、種々の化学修飾法により活性中心残基の探索を進めた。この結果、本酵素は水溶性カルボジイミドによるカルボキシル基の修飾によってのみ顕著な失活をおこすことが示され、カルボキシル基の活性発現への関与が確認された。また、還元・カルボキシメチル化リボヌクレア-ゼAを基質として、その特異性を検索し、アスパラギン、アスパラギン酸,グルタミン,グルタミン酸等のカルボキシル側をかなり選択的に切断するという,ペプシン型酵素とは異なる特異性を有することを明らかにした。一方、本酵素の高次構造の研究の一環として、その熱変性特性を解析するとともに、軽鎖を単離し、二次元NMRによりそのほゞ全残基(39個)のプロトンのクロスピ-クのシグナル〓属を行った。さらに,プロプロクタ-ゼcDNAをT7プロモ-タ-を用いたプラスミドに組み込み、大腸菌で発現させ、酸性条件下で活性化し、プロテア-ゼ作用を持つ酵素を得る系を確立した。
2.ヒト胃カテプシンEの中性域における活性の有無を検索し、中性pHにおいても活性を示すこと,また基質特異性がpHによって異なり、中性ではより狭くなることを明らかにし、カテプシンEが中性の生理的pH条件下でも作用しうることを初めて明らかにした。また、カテプシンEがpH5.5〜7.4間でα_2マクログロブリンと作用し、阻害されることを初めて示した。
3.Aspergillus nigerの産生する酸性プロテア-ゼBについて、そのcDNAを単離し、翻訳領域の塩基配列を決定した。この結果、プロテア-ゼBの前駆体プレプロプロテア-ゼBの全一次構造が明らかになった。また、プロ体の大腸菌での発現に成功し、酸性pH下で自己触媒的に活性化することを明らかにした。
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[Publications] S.B.P.Athauda: "Autocatalytic processing of procathepsin E to cathepsin E and their structural differences" Biochemical Biophysical Research Communications. 175. 152-158 (1991)
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[Publications] K.Takanashi: "The Primary Structure of Aspergillus niger Acid Proteinase A" Journal of Biological Chemistry. 266. 19480-19483 (1991)
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[Publications] H.Inoue: "The Gene and Deduced Protein Sequences of the Zymogen of Aspergillus niger Acid Proteinase A" Journal of Biological Chemistry. 266. 19484-19489 (1991)
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[Publications] S.B.P.Athauda: "Protelytic activity and eleavage specificity of cathepsin E at the physiological pH as examined towards the B chain of oxdized insulin" FEBS Letters. 292. 53-56 (1991)
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[Publications] E.Yakabe: "Purification,Characterization,and Amino Acid Sequences of Pepsinogens and Pepsins from the Esophageal Mucosa of Bullfrog (Rana catesbeiana)" Journal of Biological Chemistry. 266. 22436-22443 (1991)
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[Publications] H.Matsuzaki: "Effect of Dimethylsulfoxide on the crystallization of Aspergillus niger Proteinase A" Proceedings of the Japan Academy. 67. 209-212 (1991)
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[Publications] M.Tanokura: "Crystallization and Preliminary Xーray Investigation of Proteinase A,a Nonーpepsinーtype Acid Proteinase from Aspergillus niger var.macrosporus" Journal of Molecular Biology. 223. 373-375 (1992)
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[Publications] K.Takahashi: "Structure and Function of a PepstatinーInsensitive Acid Proteinase from Aspergillus niger var.Macrosporus" Advances in Experimental Medicine and Biology. 306. 203-211 (1992)
