ウシキモシンおよびムコ-ルレンニンの蛋白工学的研究

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02454062
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 別府 輝彦 東京大学, 農学部, 教授 (80011873)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西山 真 東京大学, 農学部, 助手 (00208240) ; 堀之内 末治 東京大学, 農学部, 助教授 (80143410)
• Keywords: アスパラギン酸プロテア-ゼ / キモシン / ムコ-ルレンニン / 蛋白工学 / 部位特異的変異 / サブサイト / 反応遷移状態 / リフォ-ルディング

Research Abstract

まず、第一にムコ-ルレンニンの酵素活性に重要な機能を果たすと思われるTyr75について新たに2種類の変異酵素を加え、合計17種類の変異酵素を取得した。部分的に配列を変えた9種類の合成基質に対して、活性を持つ2種類の変異型酵素(Y75N及びY75F)と無変異型酵素を用いて反応速度論的解析を行ったところ、変異型酵素は同様に無変異型酵素に比べてkcat/kmが大幅に低下していた。また、活性のないY75S変異型酵素を用いて基質類似の特異的阻害剤ペプスタチントの相互作用を解析したところ、無変異型酵素と同様に基質と1対1で結合していることが明らかになった。以上の結果より、75番部位は従来考えられていた基質認識を担うというよりも酵素ー基質複合体の反応遷移状態の安定化に寄与していると考えられた。次に、第二に基質と広く結合していると予想される部位の改変について行った。新たに10種の変異酵素を加え、合成17種の変異酵素を取得した。活性中心から遠いS3サブサイトのE13Qで、kcat/Kmが低下していた。以上得られたムコ-ルレンニンの変異酵素のうち、Y75N,E12T,F220E,F200Lでは耐熱性が低下しており、さらにY75Nでは凝乳活性とプロテア-ゼ活性の比の値が上昇するなど、実用上好ましい性質を示す改良を行うことに成功した。最後に第三にプロキモシンのリフォ-ルデイングにおいてN末アミノ酸の重要性について検討した。トリプトファンリ-ダ-ペプチドを持つCR601のリフォ-ルデイングには酸性アミノ酸の導入が効果的であった知見から、本来のN末を持つCR712の1番目のアミノ酸に酸性アミノ酸を導入した(A1E)ところ、変換効率は一段階透析において1.5倍に上昇したが、多段階透析では逆に2/3に低下した。一方、CR712の2番目の酸性アミノ酸を除去する(E21、E2K)と変換効率は透析の方法とは関係なく低下することから、本来ある酸性アミノ酸がリフォ-ルデイング過程に重要な働きを担っていることが示された。

Research Products

• [Publications] 米沢 実: "Role of the NH_2ーterminal amino acid sequences determining the in vitro refolding process of prochymosin polypeptide"
• [Publications] 相川 順一: "Contribution of Tyrosine on the Flap for Catalysis of an Aspartic Proteinase of Mucor Pusillus,Macor rennin,Analyzed by Siteーdirected Mutagenesis"
• [Publications] 相川 順一: Plenum, (1992)
• [Publications] 堀之内 末治: Springer, (1992)