1990 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳動物アスパラギン酸アミノ基転移酵素の構造と触媒機能の動的相関
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02454148
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
森野 能昌 熊本大学, 医学部, 教授 (30028352)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 講師 (20112401)
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| Keywords | アミノ基転移酵素 / アスパラギン酸 / 遺伝子工学 / アミノ酸置換 / Induced fit / 触媒機能 / 酵素構造 / ビタミンB6 |
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| Research Abstract |
細胞質に局在するブタ・アスパラギン酸アミノ基転移酵素(cGOT)を組換DNA手法により、目標とするアミノ酸残基を系統的に他のアミノ酸に置換した結果もたらされる酵素の構造・機能の変化を解析し、酵素触媒におけるアミノ酸側鎖の動的な役割、特に、本酵素が示す“induced fit"の分子機構を解明することを目的とした。アミノ酸置換の計画に従い、アミノ基末端セグメント領域内のVa115をAsp,Asnに、Leu16をProに置換した変異酵素を作成し、触媒活性の低下を観察した。熱抵抗性、Protease#401限定分解に対する感受性について解析したところ、これらの変異酵素は著しく抵抗性を増していることが明かとなった。この実験結果は、ただ一つのアミノ酸置換によって酵素蛋白の構造安定性が数十倍増加するが、その結果、アミノ基末端セグメントの構造可塑性が失われ、触媒作用に重大な変化がひきおこされたことを示している。Phe18をHisに置換した変異酵素を作成し、これらの新たに導入したアミノ酸側鎖をリポ-タ-グル-プとしてNMRによる分光学的解析をおこなった。Val37,Gly38位のアミノ酸をAlaやSerに置換した変異酵素を作成した。補酵素結合状態を1Hー,13CーNMR,CDスペクトルの測定によって観察したが、いずれの変異酵素においても、変化は認められなかった。一方、触媒機能の解析を行い、4種の基質、および基質アナログとの反応をストップド・フロ-法により解析し、基質の結合過程と律速段階の動力学的パラメ-タ-を得た。その結果、G38の変異は触媒活性に著明な影響を及ぼすことが明かとなった。X線による構造解析米国・アイオワ大Arnone研究室に変異酵素試料(V37A,G38S)を送付し、解析に必要とされる結晶を得たとの報告を受けている。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Fukumoto,Y.et.al.: "Structural and Functional Role of Aminoーterminal Region of Porcine Cytosolic Aspartate Aminotransferase: Catalitic and Structural Properties of Enzyme Derivatives Turncated on the aminoーterminal side." J.Biol.Chem.266. IN PRESS (1991)
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[Publications] Higaki,H.et.al.: "Porcine Cytosolic Aspartate Aminotransferase Reconstituted with [4'ー13]pyridoxal phospate.pH and Ligand Induced Changes of the Coenzyme Obserbed by 13C NMR Spectroscopy." Biochemistry. 30. IN PRESS (1991)
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[Publications] Kuramitsu S.et al.: "Preーsteadyーstate Kinetics of Eschericia coli Aspartate Aminotransferase Catalyzed Reactions and Thermodynamic Aspects of Its Substarte Specificity." Biochemistry. 29. 5469-5476 (1990)
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[Publications] Morino,Y.et al.: "Mammalian Aspartate Aminotransferase Isozemes.ーFrom DNA to Proteinー" Annals New York Acad.Sci.585. 32-47 (1990)
