EーFハンドとZincフィンガ-をもつ脂質リン酸化酵素,DGキナ-ゼの機能

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02454157
• Research Institution: Sapporo Medical College
• Principal Investigator: 加納 英雄 札幌医科大学, 医学部, 教授 (70045475)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 伸一 札幌医科大学, 医学部, 助手 (20213209) ; 坂根 郁夫 札幌医科大学, 医学部, 助手 (10183815) ; 山田 恵子 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80045541)
• Keywords: ジアシルグリセロ-ルキナ-ゼ / EFーハンド / 亜鉛フィンガ- / カルシウム結合タンパク質 / 情報伝達 / Tーリンパ球 / ホスファチジン酸

Research Abstract

我々は動物ジアシルグリセロ-ル(DG)利用酵素としては初めて、80KDGキナ-ゼのcDNAクロ-ニングに成功したが(Nature,1990)、この結果Ca^<2+>結合部位であるEFハンドと亜鉛フィンガ-を併せもつ、新しい機能タンパク質の存在が明らかになった。
1)80KDGキナ-ゼのEFーハンドの機能
精製酵素を用いて検討したところ(JBS,1991),本酵素は高親和性の(Kd=300nM)Ca^<2+>結合タンパク質であり、モル当たり2モルのCa^<2+>を結合すると、ホスファチジルセリン(PS)による活性化を受けることがわかった。さらに大腸菌とCos7細胞での欠失型、短縮型cDNA発現実験を行なった(BBRC,1991)。Ca^<2+>非存在下ではEFハンド領域は自己阻害部位として酵素によるPS結合を妨げているが、Ca^<2+>結合時にコンフォメ-ション変化を起こし、この結果DGキナ-ゼのPS結合領域が露出する。
2)ラット80KDGキナ-ゼ
ラット80Kキナ-ゼcDNAをクロ-ン化し、in situ hybridizationと免疫組織染色を行なった(投稿中)。本酵素はTーリンパ球に大量に発現しているが、脳ではoligo dendrocytesに限局して発現しており、ミエリンの成熟度に一致した発現調節を受けることが分かった。
3)ヒト血小板DGキナ-ゼ
ヒト血小板より3種類のDGキナ-ゼを精製し、いずれも80K酵素とは免疫学的に区別されることを示した。(JBC,1990)。
4)検討中の課題
80K酵素のヒト遺伝子に関しては、転写開始点を決定し、5'領域のプロモ-タ-活性をCAT assayにより検討している。亜鉛フィンガ-の機能を調べるために、点変異導入酵素をBaculovirus/Sf9細胞で発現中である。Tーcell hybridoma刺激時のDGキナ-ゼの動態を免疫的手法で検討中である。

Research Products

• [Publications] Kanoh,Hideo: "Diacylglycerol kinase:a key modulator of signal transduction?" Trends in Biochemical Sciences. 15. 47-50 (1990)
• [Publications] Sakane,Fumio: "Porcine diacylglycerol kinase sequence has zinc finger and EーF hand motifs" Nature. 344. 345-348 (1990)
• [Publications] Yada,Yukihiro: "Purification and characterization of cytosolic diacylglycerol kinases of human platelets" Journal of Biological Chemistry. 265. 19237-19243 (1990)
• [Publications] Imaizumi,Toshio: "Nonーheparinーbinding endothelial cell growth factor from bovine omentum" Experimental Cell Research. 187. 292-298 (1990)
• [Publications] Sakane,Fumio: "Porcine 80 kDa diacylglycerol kinase is a calciumーbindind and calcium/phospholipid dependent enzyme and undergoes calcium dependent translocation" Journal of Biological Chemistry. 266. 7096-7100 (1991)
• [Publications] Sakane,Fumio: "The regulatory role of EFーhand motifs of pig 80K diacylglycerol kinase as assessed using truncation and deletion mutants" Biochemical and Biophysical Research Communications. 181. 1015-1021 (1991)
• [Publications] Goto,Kaoru: "Specific expression of 80 kDaーdiacylglycerol kinase and its gene in oligodendrocytes of the rat brain." Journal of Neuroscience.
• [Publications] 加納 英雄: "カルモデュリン様構造と亜鉛フィンガ-をもつジグリセリドキナ-ゼ" 蛋白質核酸酵素. 35. 1558-1563 (1990)
• [Publications] 加納 英雄: "ジアシルグリセロ-ルキナ-ゼ" 実験医学. 8. 2043-2048 (1990)
• [Publications] 坂根 郁夫: "ジアシルグリセロ-ルキナ-ゼの一次構造と活性調節" 蛋白質核酸酵素. 36. 290-298 (1991)
• [Publications] 加納 英雄: "ジグリセリドキナ-ゼーカルシウムセンサ-をもつ情報伝達制御因子" 代謝. 28. 101-106 (1991)
• [Publications] 加納 英雄: "リン脂質合成酵素研究の新しい展開" New Lipids.(日本油脂株式会社). 3. 1-6 (1991)
• [Publications] Kanoh,Hideo(ed.by E.A.Dennis & D.E.Vance): "Diacylglycerol kinase isozymes from brain and lymphoid tissues.(Methods in Enzymology,Vol.209)" Academic Press,San Diego,U.S.A., 162-172(11) (1992)
• [Publications] 山田 恵子: "ジアシルグリセロ-ルキナ-ゼ(新生化学実験講座.第4巻)" 東京化学同人, 355-366(12) (1991)
• [Publications] 加納 英雄: "DGキナ-ゼ Neurosuence講座V,セカンドメッセンジャ-と産生酵素(竹縄,野村編)" 広川書店,
• [Publications] 坂根 郁夫: "DGキナ-ゼ 生物薬科学講座IV 生体膜の構造と機能(石橋,寺田編)" 広川書店,