1990 Fiscal Year Annual Research Report
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02454430
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
滝口 久 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (00050013)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斉藤 重野 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (60072394)
早川 光央 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (10112955)
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| Keywords | 歯周病 / 遺伝子工学 / DNA診断 / PCR法 / DNAプロ-ブ |
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| Research Abstract |
<Bacteroides>___ー <gingivalis>___ーのリボゾ-ムRNAの分離精製を行いcDNAクロ-ニングを試みた。得られた遺伝子クロ-ンからDNAを分離し、 ^<32>P放射性標識した後、他の歯周病原菌染色体DNAとハイブリダイゼ-ション実験を行った。その結果、種々の程度で交叉反応が見られた。そこで、比較的交叉反応性が低いクロ-ンを選び、制限酵素で切断したDNA断片を分離して、同様のDNAハイブリダイゼ-ション実験を行った。その結果、リボゾ-ムRNAクロ-ンDNAは、他の歯周病原菌の一部、特にB__ー.<intermedius>___ーとホモロジ-が認められ、特異遺伝子領域を特定することが困難で煩雑であることが示唆された。そこでDNA probeをリボゾ-ムRNAから特異抗原蛋白質遺伝子に変更した。すなわち、それぞれの歯周病原菌に対する抗血清を用いて、特異抗原蛋白質遺伝子をクロ-ニングした。そして、他の歯周病原菌に対する抗血清で認識されないクロ-ンをスクリ-ニングすることにより、Bacteroides <gingivalis>___ー、<Toreponema>___ー <denticola>___ーについて特異抗原蛋白質遺伝子のクロ-ンを得る事に成功した。これらのクロ-ンDNA制限酵素切断断片を用いて、他の歯張病原菌染色体DNAとハイブリダイゼ-ション実験を行い、特異性が高い領域を特定した。次に、特異性の高い遺伝子領域の塩基配列を解読して、PCR法用のるDNA primerを化学合成し、耐熱性ポリメラ-ゼによる特定遺伝子の増幅を行い検出を試みた。一般にDNA probeの放射性標識は、実験過程が複雑で時間もかかる上に ^<32>Pの半減期が短いことから、DNA probeの寿命が短い。そこで非放射性標識DNA probeによるPCR増幅した歯周ポケット中の微量細菌の検出を試みた。その結果。従来の方法では検出できなかった微量試料でも非放射性免疫学的染色法によって、臨床レベルで特異的な検出が可能であった。
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[Publications] Y.ABIKO: "Cloning of a <Bacteroides>___ー <gingiualis>___ー outer membrane protein gene in <Escherichia>___ー <coli.>___ー" Archs.oral Biol.35. 689-695 (1990)
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[Publications] Y.ABIKO: "Use of an Outer Membrane Gene DNA probe for the Identification of <Bacteroides>___ー <gingivalis>___ー." Archs.oral Biol.
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[Publications] M.HAYAKAWA: "Cloning of a <Treponema>___ー <denticola>___ー Antigen Recognized by Patients Serum with Periodoutal Diseased." Oral Microbiol.Immunol.
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[Publications] H.TAKIGUCHI: "Nonーisotopic DNA Probe for the Identification of <Treponema>___ー <denticola>___ー Species." Int.J.Biochem.
