DNAの複製及び修復の制御機構におけるクロマチン構造の関与

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02454489
• Research Institution: RIKEN (The Institute of Physical and Chemical Research)
• Principal Investigator: 花岡 文雄 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 主任研究員 (50012670)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮沢 宏 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 研究員 (40183967)
• Keywords: SV40ウイルス / ミニ染色体 / 無細胞複製系 / DNAトポイソメラ-ゼ / 無細胞修復系 / 色素性乾皮症

Research Abstract

前年度に確立した精製蛋白質によるSV40ウイルスのミニ染色体無細胞複製系を用い、ヌクレオソ-ム構造をとったDNAの複製にDNAトポイソメラ-ゼI(topoI)およびII(topoII)かどのように関与しているかを調べた。SV40の裸のDNAをtopoIあるいはtopoIIのどちらか一方を含む反応液中で複製させると、いずれの場合も鋳型の半分の長さのleading鎖(約2,700ヌクレオチド)と100〜300ヌクレオチド(岡崎断片)が作られ、DNA合成は完了した。一方、SV40のミニ染色体をtopoIを含む反応液中で複製させると、岡崎断片と1,800ヌクレオチドを平均とする不均一な長さのleading鎖が合成された。この系にtopoIIを加えた場合、あるいはtopoIIのみを含む反応液では、leading鎖は長くなり、成熟した長さのDNA(2,700ヌクレオチド)のみが合成された。これらの結果は、裸のDNAとヌクレオソ-ム構造をとったDNAの複製ではtopoIIの要求性が異なり、SV40ミニ染色体の複製においてtopoIIは、いわゆるswivelaseとして機能することが示唆された。
一方、SV40ミニ染色体にUV照射したものを鋳型にして、無細胞染色体修復系の構築を試みた。放射標識した基質とATPの存在下、鋳型をHeLa細胞の粗抽出液と反応させ、DNAを抽出後、アガロ-スゲル電気泳動にかけ、オ-トラジオグラフィ-によって修復合成を検出した。反応液中にUV照射しない裸のプラスミドDNAを適当量共存させることにより、UV照射したSV40染色体としなかったものとで10倍以上の放射能取り込みの差が得られた。このUV損傷依存性のDNA合成は、色素性乾皮症(XP)の相補性群A、及びCに属する細胞の抽出液を用いた場合には、HeLa細胞抽出液を用いた場合のそれぞれ1/10,及び1/3程度であり、両者を混合することにより取り込みが回復した。今後、この無細胞系はクロマチンのDNA損傷の修復機構解析に有用である。

Research Products

• [Publications] Y.Ishimi: "Replication of the simian virus 40 chromosome with purified proteins" J.Biol.Chem.266. 16141-16148 (1991)
• [Publications] Y.Ishimi: "Topoisomerase II plays an essential role as a swivelase in the late stage of SV40 chromosome replication in vitro" J.Biol.Chem.267. 462-466 (1992)
• [Publications] K.Sugasawa: "Non-conservative segregation of parental nucleosomes during simian virus 40 chromosome replication in vitro" proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89. 1055-1059 (1992)
• [Publications] 菅澤 薫: "染色体複製とヌクレオソ-ム" 実験医学. 9. 1436-1441 (1991)