1990 Fiscal Year Annual Research Report
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02454552
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
重定 勝哉 京都大学, ウィルス研究所, 助教授 (40009626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鶴下 直也 京都大学ウィルス研究所, 助手 (30201643)
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| Keywords | 転写終結因子 / rho遺伝子 / 大腸菌転写制御 / PCR / in vitro 変異誘発 / 発現ベクタ- / タ-ミネ-タ- / RNA依存性ATPase |
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| Research Abstract |
本研究は多様な変異を含むrho遺伝子のライブラリ-を構築し、それを利用することによりrho蛋白の分子構造と機能の連関を詳細に解明することを目的とする。今年度は、まず変異の導入・選択・解析の各操作を効率よく連係的に遂行するための実験システムを確立することを目指して、以下の研究を進めた。
1.変異導入法の開発:約1200塩基対からなるrhoの構造遺伝子を200ー300塩基対ずつ数個の断片に分割し、PCR反応を応用したin vitro変異誘発法により各断片毎に変異を導入した。変異を持つ断片は後述のプラスミド発現ベクタ-に組み込むことにより完全な遺伝子に再構成し、機能的選択および塩基配列解析を簡便に行うことが出来るようにした。手始めにrho蛋白のC末端領域100アミノ酸残基に変異導入を行ったところ、実際に1箇所ないしそれ以上の変異が標的ブロック内に限局して高頻度で検出され、この方法が非常に有効であることが確認された。
2.変異選択のための発現ベクタ-の構築:pBR322由来のプラスミド上にlacプロモ-タ-、rho依存型タ-ミネ-タ-λtR1およびrho構造遺伝子をこの順に配置した発現ベクタ-を作製した。このベクタ-を大腸菌に導入しIPTG添加によりlacプロモ-タ-を誘導すると、rhoに機能異常があれば菌の増殖阻害が起こることが確認され、この性質を利用して変異rhoのクロ-ンを容易に選択することが可能になった。
3.変異rho蛋白の機能解析:上で作製したC末端領域変異分ライブラリ-よりこれまでに数個のrho変異株を分離し、それらのつくるrho蛋白を精製して性質を調べたところRNA依存性ATPase活性に異常のあることが示された。この結果からC末端領域がrhoのRNA相互作用能とATPase機能とを共役させる上で重要な役割を担うことが新たに判明した。
以上の成果を基盤として、今後さらにrho遺伝子全域について変異ライブラリ-を完成させ、解析を進めて行く予定である。
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[Publications] Shigesada,K.: "PCRーmediated in vitro mutagenesis of the transcription termination factor protein rho from Escherichia coli" J.Mol.Biol.,submitted.
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[Publications] Zu,Y.: "65ーkilodalton protein phosphorylated by interleukin 2ーstimulation bears two putative actinーbinding sites and two calciumーbinding sites" Biochemistry. 29. 8319-8324 (1990)
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[Publications] Furukawa,K.: "A ubiquitous repressor interacting with an F9 cellーspecific silencer and its functional suppression by differentiated cellーspecific positive factors" Cell Growth & Differ.1. 135-147 (1990)
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[Publications] Kawamura,T.: "Phosphoenolpyruvate carboxylase prevalent in maize roots.Isolation of a cDNA clone and its use for analyses of the gene and gene expression" J.Biochem (Japan). 107. 165-168 (1990)
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[Publications] Ito,Y.: "GENES AND CANCER,ed.by D.Carney and K.Sikora Part B.,11.Modulation of transcription by oncogenes" John Wiley & Sons, 348 (1990)
