遺伝子増幅法を用いた植物ウイルス・ウイロイドの高感度遺伝子診断法の実用化

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02556007
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 四方 英四郎 北海道大学, 名誉教授 (00001389)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉本 宣敬 有機合成薬品工業(株), 生化学研究室, (研究担当)室長 ; 大島 一里 北海道大学, 農学部, 助手 (00176869) ; 上田 一郎 北海道大学, 農学部, 助教授 (10113523) ; 小島 誠 新潟大学, 農学部, 教授 (00001454)
• Keywords: PCR / 遺伝子診断 / 植物ウイルス / 塩基配列

Research Abstract

1)RCRとマイクロプレ-トを用いた液相ハイブリダイゼ-ションによる遺伝子診断法を試みた。本法によってジャガイモYウイルスでは5fgのゲノムが検出可能であり、従来のナイロンメンブレンを用いたハイブリダイゼ-ションよりはるかに鋭敏であった。本法は、プロ-ブにDIG標識法を用いるのでアイソト-プ標識より安全なので、放射性物質取扱い規制を受けずに一般実験室で遺伝子診断が出来るようになった。
更にホップ潜在ウイロイドとキク矮化ウイロイドでも本法による遺伝子診断が可能となった。
2)イネ萎縮ウイルスゲノムセグメント1と12、イネ黒条萎縮ウイルスゲノムセグメント7と8、イネラギッドスタントウイルスゲノムセグメントS9と10、ジャガイモYウイルスの非翻訳領域、ダイズモザイクウイルスの3'未端領域、キク矮化ウイロイド、ホップ潜在ウイロイドの塩基配列を決定し、これらの特異領域を基にして増幅用および検定用プライマ-を合成できるようにした。
3)RCR反応におけるDNA汚染対策を検討した。検体植物より全核酸を抽出する際に最も汚染しやすいことが明らかとなった。
4)植物レオウイルス遺伝子を簡易迅速に抽出し、PCR法によってcDNAクロ-ニングする方法を開発した。本法によって、特定の遺伝子変異を迅速に検定できるようになった。

Research Products

• [Publications] H.Kudo: "Viruses in the phytoreovirus genus of the Reoviridae family have the same conserved terminal sequences" J.gen.Virol. 72. 2857-2866 (1991)
• [Publications] 大島 一里: "ジャガイモYウイルス普通系統およびえそ系統の外被タンパク質のアミノ酸配列と生物学的、血清学的比較" 日植病報. 57. 615-622 (1991)
• [Publications] I.Uyeda: "Bean yellow mosaic virus subgroup:search for the group specific Sequences in the 3'terminal region of the genome." Archives of Virology. (1992)
• [Publications] Y.Sano: "On the variability of the 3'terminal sequence of the turnip mosaic virus genome." Archives of Virology. (1992)
• [Publications] J.Yan: "Conserved terminal sequences of rice ragged stunt Virus genomic RNA." J.gen,Virol. (1992)
• [Publications] F.Azuhata: "Terminal conserved nucleotide sequences of the genome of rice black-streaked dwarf virus." J.gen.Virol. (1992)