脳内神経伝達物質受容体に対する抗体を用いた神経回路網の免疫組織化学的検索法の確立

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02557011
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 栗山 欣弥 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (20079734)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 廣内 雅明 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (70181196)
• Keywords: GABA_A受容体 / GABA_B受容体 / モノクローナル抗体 / 免疫組織化学 / インミュノアフィニティ精製 / 再構成 / 電顕的免疫細胞化学 / 小脳

Research Abstract

脳内のGABA_B受容体に対するモノクローナル抗体を作製すると共に,GABA_A及びGABA_B受容体に関する免疫組織化学的研究を行ない、次の結論を得た。1)バクロフェン・アフィニティ カラム部分精製したGABA_B受容体蛋白を抗原として、GABA_B受容体に対するモノクローナル抗体を得た。この抗体はシナプス膜内の8OKDaの蛋白を認識した。2)またこの抗体を用いてimmunoaffinitycolumnを作製し、ウシ脳からGABA_B受容体の精製を試みたところ,8OKDaの蛋白が得られた。この蛋白はGABA_B受容体としての薬理学的特性を有し、また精製したGi/Go蛋白及びアデニレートサイクレースと共に人工リン脂質膜上で再構成すると、シナプス膜上でみられるGABA_B受容体としての機能、すなわち、GABA_B受容体作働薬添加に伴うcAMP産生の抑制が認められた。従ってこの8OKDaの蛋白はGABA_B受容体であること、また今回作製したモノクローナル抗体はGABA_B受容体を特異的に認識すると判断した。3)上記のGABA_B受容体モノクローナル抗体を用いて、脳内における局在をGABA_A受容体(AB)抗体及びGABA抗体の場合と比較検討した。例えば胎児脳の上丘の場合、GABA神経終末に一致して、受容体の存在が認められるが、GABA_A受容体とGABA_B受容体の分布には明かな違いがみられ、両者をあわせてGABA神経終末のシナプス後性領域をカバーしていることが判明した。4)GABA_A受容体の脳内における免疫組織化学的分布をみると、小脳では、顆粒細胞膜と核膜の一部及び小脳系球に豊富に分布する顆粒細胞樹状突起シナプス後膜に免疫陽性粒子が密に認められた。一方、黒質緻密部網様部では、樹状突起や細胞体のシナプス後膜に免疫陽性粒子が密に認められた。現在これらのGABA_A及びGABA_B受容体の免疫組織化学的検索法を用いて、更に検討を進めている。

Research Products

• [Publications] H.Nakayasu: "Immunoaffinity purification and characterization of γ-aminobutyric acid(GABA)_B receptor from bovin cerebral cortex" Journal of Biological Chemistry. (1993)
• [Publications] 栗山 欣弥: "モノクローナル抗体を用いたGABA受容体の免疫組織化学:GABA_B受容体を中心として" 日本薬理学雑誌. (1993)
• [Publications] M.Hirouchi: "Alteration in expression of GABA_A receptor α1-subunit mRNA in brain following continuous ethanol administration" European Journal of Pharmacology. (1993)
• [Publications] K.Kuriyama: "Structure and function of GABA_B receptor in bovin cerebral cortex:Analysis using the purified receptor and monoclonal antibody" Pharmacology Communications. 2. 15-19 (1992)
• [Publications] H.Hirouchi: "Muscimol-induced reduction of GABA_A receptor α1-subunit mRNA in primary cultured neurons" Molecular Brain Research. 15. 327-331 (1992)
• [Publications] H.Nakayasu: "Monoclonal antibody to GABA binding protein,a possible GABA_B receptor" Biochem.Biophys.Res.Commun.182. 722-726 (1992)
• [Publications] H.Nakayasu: "Frontiers and New Horizons in Amino Acid Research" Elsevier Science Publ., 8 (1992)
• [Publications] K.Kuriyama: "Drug Research Related to Neuroactive Amino Acids" Munksgaard Int.Publ., 9 (1992)