抗体cDNA発現による細胞内機能蛋白欠損変異細胞株の樹立

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02557013
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 額田 敏秀 東京大学, 医学部(医), 講師 (80189349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 真人 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員 ; 佐藤 尚武 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員 ; 芳賀 達也 東京大学, 医学部, 教授 (30011646)
• Keywords: G蛋白質 / 単クロ-ン抗体 / cDNAクロ-ニング / ホスホリパ-ゼC / 免疫グロブリン / 百日咳毒素 / ムスカリン受容体 / ウェスタンブロッティング

Research Abstract

1.マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞の細胞融合法を用いて、G蛋白質αサブユニット(GL1α・GL2α・Gi1α・Goα)C末端のペプチドに対する、また脳から精製したG蛋白質βサブユニットに対する単クロ-ン抗体を産生する細胞をクロ-ン化した。その結果、GL1αに対する単クロ-ン抗体産生細胞として3クロ-ン(IgMサブクラスが2、IgG1が1)、GL2αに対しては1クロ-ン(IgG1)、Gi1αに対しては1クロ-ン(IgM)、Goαに対しては1クロ-ン(IgG1)、βサブユニットに対しては1クロ-ン(IgG1)得られた。2.免疫グロブリンの重鎖(γ1・μ)及び軽鎖(κ)それぞれについて、アミノ酸の相同性の高い部分即ち成熟免疫グロブリンのN末とC末部分に相当するヌクレチオド配列を基にPCR(polymerase chain reaction)用のプライマ-を合成した。3.上で得られた単クロ-ン抗体産生細胞より総RNAを調製し、逆転写酵素により1本鎖cDNAを合成し、上述のプライマ-を用いたPCR法で免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖に対するcDNAをクロ-ニングした。ヌクレオチド配列解析より、それぞれのクロ-ンは免疫グロブリン蛋白をコ-ドしていた。現在、GL1α・Gi1α・Gβに対する抗体遺伝子のcDNAクロ-ニングに成功している。GL2αについては続行中である。4.免疫グロブリンcDNAの細胞内誘導発現の為、熱ショック蛋白プロモ-タ-を有する発現ベクタ-、及び熱ショック蛋白プロモ-タ-と選択マ-カ-のネオ遺伝子転写ユニットが直列に組み込まれた発現ベクタ-を作製した。今後は、この2つの発現ベクタ-にそれぞれ重鎖及び軽鎖に対するcDNAを組み込み、co-transfection法により培養細胞に導入し、ネオマイシンのアナログであるG418で選別の後、42℃の熱ショックをかけた時に見られる細胞内変化を検討していく予定である。

Research Products

• [Publications] Fumio Nakamura: "Identification of Two Novel GTP-binding Protein α-Subunits that Lack Apparent ADP-ribosylation Sites for Pertussis Toxin" Journal of Biological Chemistry. 266. 12676-12681 (1991)
• [Publications] Kazuko Haga: "Activation by G protein βγ-Subunits of Agonist- or Light- Dependent Phosphorylation of Muscarinic Acetylcholine Receptors and Rhodopsin" Journal of Biological Chemistry. 267. 2222-2227 (1992)