1992 Fiscal Year Annual Research Report
抗体cDNA発現による細胞内機能蛋白欠損変異細胞株の樹立
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02557013
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| Research Institution | Tokyo University |
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Principal Investigator |
額田 敏秀 東京大学, 医学部(医), 講師 (80189349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 真人 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員
佐藤 尚武 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員
芳賀 達也 東京大学, 医学部(医), 教授 (30011646)
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| Keywords | G蛋白質 / 単クローン抗体 / cDNAクローニング / ホスホリパーゼC / 免疫グロブリン / 百日咳毒素 / ムスカリン受容体 / 免疫ブロッティング |
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| Research Abstract |
1.各種G蛋白質αサブユニット(GL1α、GL2α、Gi1α、Goα)に対する単クローン抗体産生細胞より、Polymerase Chain Reaction(PCR)法及びcDNAライブラリーのスクリーニングで抗体の重鎖(γ^1とμ)と軽鎖(κ)のcDNAをクローニングした。cDNAのヌクレオチド配列解析から、各単クローン抗体重鎖と軽鎖の可変領域に対するアミノ酸一次構造を決定した。2.抗体重鎖と軽鎖cDNAが同時に分泌蛋白質として大腸菌で発現できる、ファージ・ベクターλHLを構築した。抗GL1α、Gilα抗体のμ鎖+κ鎖cDNAを有するλHLファージを大腸菌に感染させ、ペリプラズマの白質を抗マウス免疫グロブリン抗体を用いた免疫ブロッティングで調べた。μ鎖とκ鎖がペリプラズマ中に分泌されてS-S結合を形成し、μ_2 κ_2の4量体となることが分かった。このようにして得られた抗体が、本来と同じ抗体価と特異性を持つのかを現在検討中である。3.PCR法でクローニングした単クローン抗体cDNAは、N末端が分泌シグナルの取れた成熟免疫グロブリンの頭から始まっており、これらをマウス乳癌ウィルス或いはショウジョバエ熱ショック蛋白質プロモーターの下流に翻訳開始メチオニン・コドンを有する発現ベクターにin frameに組み換えた。今後は、各々のG蛋白質αサブユニットが発現している培養細胞に、それぞれ重鎖と軽鎖cDNAを組み込んだ発現ベクターを共トランスフェクションし、デキサメサゾン或いは熱ショックでプロモーター活性を誘導して細胞内に抗体蛋白質を発現させ、この時に生ずる細胞内変化を検討していく予定である。4.バキュロウィルスとSf9細胞を用いたG蛋白質αサブユニットの大量発現系を確立した。膜画分からの可溶化が困難であったGL1α、GL2αも、G蛋白質β^1 γ^2サブユニットをαサブユニットと同時にSf9細胞内で発現させることにより可溶化が可能になった。
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[Publications] Kazumasa Shiozaki: "Effects of Magnesium Ion on the Interaction of Atrial Muscarinic Acetylcholine Receptors and GTP-Binding Regulatory Proteins" Biochemistry. 31. 10634-10642 (1992)
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[Publications] Tatsuya Haga: "Phosphorylation of Muscarinic Receptprs:Regulation by G Proteins" Life Sciences. 52. 421-428 (1993)
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[Publications] Ago Rinken: "Solubilization and Characterization of Atrial Muscarinic Acetylcholine Receptors in Sucrose Monolaurate" Archives of Biochemistry and Biophysics. 301. (1993)
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[Publications] D.A Brown: "Coupling of Muscarinic Receptor Subtypes to Ion Channels:Experiments on Neuroblastoma Hybrid Cells" Annu.New York Acad.Sci.(1993)
