抗サイログロブリン自己抗体の新しい超高感度疫測定法の実用化

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02557019
• Research Institution: 宮崎医科大学
• Principal Investigator: 石川 栄治 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (40029939)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 喜昭 住友製薬(株), 研究開発推進部, 部長
• Keywords: 抗サイログロブリン抗体 / 自己抗体 / サイログロブリン / 酵素免疫測定法 / 免疫複合体転移測定法 / 自己免疫疾患 / 甲状腺

Research Abstract

血清中の抗サイログロブリン自己抗体(以下抗体と略す)を超高感度で、しかも簡便、迅速に測定するために、免疫複合体転移測定法の開発を試みた。(1)2,4ージニトロフェニル(DNP)化抗原を抗体と反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップし、固相を洗浄した後、酵素標識第二抗体と反応させた。(2)DNP化抗原、抗体、酵素標識抗原の3者を同時に反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップした。固相を洗浄した後、DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出して、第二抗体不溶化固相に移した。(3)(2)のDNP化抗原と第二抗体不溶化固相の代りにDNP化ビオチン化抗原とストレプトアビジン不溶化固相を用いた。(4)DNP化酵素標識抗原を抗体と反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップし、固相を洗浄した後、DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出し第二抗体不溶化固相に移し換えた。高感度でしかも比較的簡便、迅速な(2)と(3)を採用するとともに、複合体の溶出と次の固相へのトラップを同時に行うことにより一層の迅速化を計った。標識の検出に要する時間を短縮するため、europiumを用いることを検討したが、検出感度が10amolとやや低いことと原因不明の測定値の変動があり、今後検討すべき課題を残した。抗原として用いるヒト・サイログロブリンを(抗ヒトIgG)IgGーセファロ-ズ4Bのカラムにより精製し、再現性よくバックグラウンドが低下するようにした。従来Sーアセチルメルカプトサクシニックアンハイドライドによりチオ-ル基を導入したサイログロブリンと、Nーサクシニミジルー6ーマレイミドへキサノエ-トによりマレイミド基を導入したεNーDNPーリジンを反応させ、サイログロブリンにDNP基を導入していたが、DNPカルボン酸の活性エステルを合成し、直接DNP基を導入できるようにした。新しい形の固相を開発することを検討したが、試作品が250万円と高価なため発注を見合せた。

Research Products

• [Publications] Takeyuki Kohno,et al.: "Sensitive timeーresolved fluorimetric immuneーcomplexーtransfer immunoassay for antithyroglobulin IgG in serum." Journal of Clinical Laboratory Analysis. 4. 224-230 (1990)
• [Publications] Eiji Ishikawa,et al.: "Ultrasensitive enzyme immunoassay." Clinica Chimica Acta. 194. 51-72 (1990)
• [Publications] Eiji Ishikawa,et al.: "Development of ultrasensitive enzyme immunoassay reviewed with emphasis on factors which limit the sensitivity." Molecular and Cellular Probes. (1991)