骨形成因子ファミリ-の動物細胞での発現とモノクロ-ナル抗体の作製

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02558017
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 上野 直人 筑波大学, 応用生物化学系, 講師 (40221105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 脇舛 光廣 武田薬品工業(株), 筑波研究所, 主任研究員
• Keywords: 骨形成因子 / 骨形成 / 軟骨形成 / TGF-β / 骨粗鬆症

Research Abstract

アフリカツメガエル骨形成因子群、BMP-2、4、7のうちBMP-2のカルボキシル末端側の21アミノ酸の合成ペプチドに対する特異抗体を作製し、この抗体がリコンビナントBMP-2と4をほぼ同等の感度(共に検出限界は5ng)で認識することを確認した。同抗体が動物細胞(CHO細胞)で発現され、培養液中に分泌されたBMPを検出することができたため、BMP精製過程でのウエスタンブロットによる検出に用いた。また特にBMP-4はマウス頭蓋冠由来MC3T3-E1細胞に作用し、骨型アルカリフォスファタ-ゼを指標とした強い骨誘導能を持つことが明らかになったため、MC3T3E1細胞を用いた生物活性測定系を確立し、BMPの検出に用いることとした。まず2種類のアッセイ系が確立しているBMP-4の大量生産を試みた。PCD(X)ベクタ-に比べ発現効率が高いことがわかっているPSD(X)ベクタ-にツメガエルBMP-4のcDNAを導入し、CHO細胞を形質転換した。同細胞をメソトレキセ-ト処理することによって、BMP遺伝子の増幅を行い、最終的に1600nMで細胞を維持することによってBMP-4の高生産株、2-16-1600株を得ることができた。無血清培地を用いて、約20リッタ-の大量培養を行い部分精製を試みた。精製ステップとして、分子量約1万の限外濾過による濃縮後、ヘパリンセファロ-ス・アフィニティ-クロマトグラフィ-、調製用逆相HPLC、調製SDSポリアクリルアミド電気泳動、分析用HPLCを用いた。最終精製標品のリコンビナントBMP-4の純度を検定したところ、分子量約4万に抗体で検出されるBMP-4のタンパク質を確認したものの約50%の夾雑タンパク質の存在を認めた。培養上清中の生物活性や部分精製BMP-4のタンパク質量から、生産量は1リッタ-当たり、10〜20μgであると概算された。また同標品はマウス筋肉へ投与することによってイン・ビボで異所性の骨形成を誘導することが、共同研究によって確認された。

Research Products

• [Publications] Ueno,N.: "Identification of Bone Morphogenetic Protein-2 in Early Xenopus laevis Embryos" Growth Factors.
• [Publications] Nishimatsu,S.: "Genes for Xenopus BMPs are developmentally regulated in early embryos" Development.
• [Publications] Suzuki,A.: "Expression and partial purification of Xenopus BMP-4"
• [Publications] 上野 直人: "初期発生における細胞増殖因子" 蛋白質核酸酵素増刊号「細胞増殖因子の基礎と臨床」. 36. 1292-1299 (1991)