電子顕微鏡試料作製のための新しい急速凍結装置の開発

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02558026
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 月田 承一郎 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 教授 (50155347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 月田 早智子 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (00188517) ; 船津 高志 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 学術特別研究員 (00190124)
• Keywords: 急速凍結 / ケ-ジド化合物 / ATP / 電子顕微鏡 / 液体ヘリウム / 時間分解能

Research Abstract

生体内の動的な現象の分子機構を明らかにする一つの手段として、ATPやカルシウムイオンなどの濃度を急激に変化させた後の構造変化を解析できる時分割電子顕微鏡法の開発が望まれている。我々は、このような時分割電子顕微鏡法を開発する目的で、ケ-ジド化合物の急速凍結電子顕微鏡法への応用を検討することにした。目標とした凍結システムは、以下の条件を満たすものである。
(1)凍結(金属圧着)の瞬間より0ー1秒前の任意のタイミングで試料に近紫外光を照射することが出来る。
(2)光照射から凍結までのタイミングを、ミリ秒以上の時間分解能で測定することが出来る。
(3)ケ-ジド化合物を充分分解できるだけの強度の光を照射出来る。
我々は、本試験研究の初年度において、この凍結システムの開発に取り組んだ。まず、これまで用いられていた光源の検討から行った。我々の凍結システムにレ-ザ-光を導入することは難かしかったので、キセノンランプ光をライトガイドで導入し、鏡で反射させて試料に照射する方式を採った。しかし、このような方式では、かなり強度の強い光源が必要であることが分かり、種々の工夫をこらして、新しいランプボックスを新たに開発し、試料中のケ-ジドATPの10%を分解できるようになった。また、凍結装置そのものに種々の測定装置を組み込み、光が試料に照射してケ-ジド化合物が分解してから何ミリ秒後に試料が凍結されたかを測定できるようになった。また、生物試料に有害な波長の光を除くためにフィルタ-も慎重に選定した。
その結果、広くいろいろな用途に用いることが出来ると考えられる新しい凍結システムが完成した。

Research Products

• [Publications] Tsukita,Sh.: "The undercoat of adherens junctions:A key specialized structure in organogenesis and carcinogenesis." Cell Struct.Funct.15. 7-12 (1990)
• [Publications] Nishikawa,S.: "Localization of adherens junction proteins along the possible sliding interface between secretory ameloblasts of the rat incisor." Cell Struct.Funct.15. 245-250 (1990)
• [Publications] Sato,N.: "Radixin,a barbedーendーcapping actinーmodulating protein,is concentrated at the cleavage furrow during cytokinesis." J.Cell Biol.
• [Publications] Muto,E.: "Doubleーrowed organization of inner dynein arms in Chlamydomonas flagella revealed by tiltーseries thinーsection electron microscopy." J.Cell Sci.
• [Publications] Tsukita,Sa.: "Specific protoーoncogenic tyrosine kinases of src family are enriched in cellーtoーcell adherens junctions where the level of tyrosine phosphorylation is elevated." J.Cell Biol.