分秘ベクタ-保有大腸菌による異種遺伝子産物の菌体外分秘生産の培養工学的研究

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02650711
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 山根 恒夫 名古屋大学, 農学部, 教授 (70026102)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀越 弘毅 東京工業大学, 工学部, 教授 (80087551)
• Keywords: 分秘ベクタ- / 大腸菌 / βーペニシリナ-ゼ / 自動流加培養法 / 濁度センサ- / 遺伝子組換え菌 / tacプモロ-タ- / Kil遺伝子

Research Abstract

(1)分秘ベクタ-保有大腸菌の流加培養(分担研究者:山根恒夫)
昨年に引き続き、プラスミドpEAP82ー1に好アルカリ性Bacillus spのペリシリナ-ゼ遺伝子を組み込んだ場合について研究した。とくに、初発培地としてトリプトンと酵母エキスを用い、培養初期にグリセロ-ルを流加し、溶菌を極力抑え、菌体濃度を20g/l程度まで高め、後半でトリプトンと酵母エキスとグリセロ-ルの3成分を種々の流量で供給するという2段階の自動流加法について詳細に調べた。その結果、2段階流加培養の培養後半でのグリセロ-ルの流加は、菌体外の酵素活性を高める上で有効であること、また流加量を多くすると、菌体濃度は高くなるが、酵母活性は高くならないこと、分秘率は実験を行ったグリセロ-ル流加の範囲ではあまり差がないことがわかった。菌体当りの菌体外酵素活性から考えると、2段階流加培養の培養後半でグリセロ-ルの流加の最適な比基質供給速度、qsf[(gーsubstrate)・(gーdry cell weight)^<-1>・h^<-1>]は0.10であると考えられる。この条件での成績は、LB培地を用いた回分培養の成績と比較して、菌体外の最大酵素活性は約20倍まで上がり、生産性[Unit・L^<-1>・h^<-1>]は約5倍となった。
(2)分秘ベクタ-の改造(分担者:堀越弘毅)
菌体外分秘ベクタ-の分秘発現の強化を目指してペニシリナ-ゼプロモ-タ-とtacプロモ-タ-を持った分秘ベクタ-pEAP85を構築した。更に好アルカリ性バチルス38ー2由来のサイクロデキストリン合成酵素(CGTase)遺伝子をこの分秘ベクタ-pEAP85や大腸菌ー枯草菌のシャトルベクタ-に導入してその分秘発現におよぼす影響を調べた。その結果、pEAP85ーCGTを持つ大腸菌においてCGTaseは高発現し、しかも大部分の活性が菌体外に分秘されることがわかった。

Research Products

• [Publications] Edgard E.TULIN: "Characteristics of Batch Cultureof aRecombinant Bacillus brevis Excreting a Foreign Esterase" Biotechnology and Bioengineering. 38. 1249-1252 (1991)
• [Publications] Yusuke AMAKI: "Purification and Properties of Thermostable Esterase of Bacillus stearothermophilus Produced by Recombinant Bacillus brevis" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 56. 238-241 (1992)
• [Publications] Tsuneo YAMANE: "Fedーbatch Culture Automated by Uses Continuously Measured Cell Concentration and Culture Volume" Biotechnology and Bioengineering.
• [Publications] George GEORGANTA: "Expression of the CGTase Gene of Alkalophilic Bacillus No.38ー2 in Various Hosts" Starke. 43. 361-363 (1991)
• [Publications] Koki HORIKOSHI: "Microorganisms in Alkaline Environments" Kodansha CO.,Ltd., 83-96 (1991)