重金属耐性細菌の耐性発現の分子機構と重金属含有廃水処理への応用

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02660111
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 河合 啓一 岐阜大学, 農学部, 教授 (00002064)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高見沢 一裕 岐阜大学, 農学部, 助教授 (00159005)
• Keywords: カドミウム耐性細菌 / 六価クロム耐性細菌 / Pseudomonas putida GAMー1 / Pseudomonas ambigua Gー1 / 重金属耐性プラスミド / カドミウム耐性遺伝子 / 挿入配列IS1 / 六価クロム還元酵素

Research Abstract

1.Pseudomonas putida GAMー1におけるカドミウム耐性の遺伝学的解析
前年度得られたカドミウム耐性形質転換株E.coli C600(pDRI)の挿入DNA断片の分子遺伝学的解析を行なった。本形質転換株の保有するpDR1の分子サイズは約5.5kbであり、pBR322のBamHIサイトに塩基数約800bpのDNAが挿入されていた。サザンブロットハイブリダイゼイションにより本挿入DNA断片がpGU100由来であることが確認された。本挿入DNA断片のサブクロ-ニングを行ない、その塩基配列の一部をジデオキシ法により決定した。この塩基配列は挿入配列IS1に極めて高い相同性があることが判明し、本カドミウム耐性形質転換株はE.coli C600のゲノムDNA中へ挿入配列が転移したことにより、何らかの原因でカドミウム耐性を獲得していることが示唆された。
2.Pseudomonas ambigua Gー1の六価クロム還元酵素
P.ambigua Gー1の超音波破壊無細胞抽出液より、DEー32及びAFーキレ-トトヨパ-ル、DEAEートヨパ-ル、セファデックスGー100、HPLC,DEAEー5WP、HPLC,HAー1000の各カラムクロマトグラフィ-操作を用いて標記憶還元酵素を精製した。本酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一の蛋白質バンドを示し、高度に精製された酵素表品を得ることができた。分子量はゲル濾過法で約65,000、SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動で約25,000と算出され、本酵素は同一のサブユニットからなる二量体であることが示唆された。補酵素としてNAD(P)Hを要求した。Cr(VI)に対する反応のVーSプロットはシグモイド型となり、ヒル係数(n)は2.6と算出された。最適温度温及び最適pHはそれぞれ60℃及び8.1〜8.6であった。また、化学量論適な解析及びESRスペクトルの結果から、本酵素がCr(V)を中間体としてCr(VI)をCr(III)にまで還元していることが示された。

Research Products

• [Publications] Keiichi Kawai: "Induction of Cadmiumーresistance of Pseudomonas putida GAMー1" Agricultural and Biological Chemistry. 54. 1553-1555 (1990)
• [Publications] Keiichi Kawai: "Expression of PlasmidーEncoded Gene for Cadmium Resistance of Pseudomonas putida GAMー1 in Escherichia coli" Journal of Fermentation and Bioengineering. 73. (1992)
• [Publications] Tohru Suzuki: "Catalytic Mechanism of NAD(P)H Dependent Chromium(VI) Reductase of Pseudomonas ambigua Gー1:Cr(V) Intermediate is Formed during the Reduction of Cr(VI)to Cr(III)" Journal of Bacteriology.
• [Publications] Tohru Suzuki: "Purification and Characterization of Cr(VI) Reductase of Pseudomonas ambigua Gー1" Journal of Bacteriology.