アミド合成に有用なニトリルヒドラタ-ゼのコファクタ-と反応機構に関する研究

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02660114
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 長沢 透 名古屋大学, 農学部, 助教授 (60115904)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 昌 京都大学, 農学部, 助教授 (70093250)
• Keywords: ニトリルヒドラタ-ゼ / 鉄酵素 / コバルト酵素 / アクリルアミド / ピロロキノリンキノン類緑体

Research Abstract

酵素を触媒とする新しい省エネルギ-型微生物生産法の研究開発の試みが注目されてきた。我々はニトリルヒドラタ-ゼによるアクリルアミドの生産に関する基礎的研究を長年に渡り検討し、既に本酵素を用いたアクリルアミド生産の工業化に成功した。本方法は大量生産型の原料素材の生産にも酵素反応が利用しうることを初めて示した画期的な研究として世果的な注目を集めている。しかしながら、このような応用的研究の進展に比べて本酵素の基礎的検討は極めて遅れていた。そこで我々は本課題としてニトリルヒドラタ-ゼのコファクタ-と反応機構に関して検討を加えた。Brevibacterium R312,Psendomonas chlororophis B23のニトリルヒドラタ-ゼは3価鉄を、Rhodecoccus rhodochrous J1のそれはコバルトをコファクタ-として含む。ESRを用いて鉄型酵素の鉄の存在状態や本水和反応機構の解析を試みたところ、本酵素は典型的なrhombic型の低スピンFe(III)のスペクトルを示した。ESRや分光学的検討からFe(III)は基質ニトリルのbindingし活性化に関与し、Fe(III)があたかもヘム環のように4方向からヒスチジンのイミダゾ-ル基と配位して存在していると予想された。また軸方向にシステインのイオウと水が配位しており、ニトリルと水がすみやかに置換することが予想された。さ に本酵素にはピロロキノリンキノン類緑化合物が含まれ、Fe(III)センタ-の近くに位置して両者が機能的に相関していることが強く示唆される研究結果を得た。コバルト型酵素においては鉄のかわりにコバルトが配位していると考えられ、やはりニトリルのbindingに寄与している。しかしながらコバルト酵素にはピロロキノリン類緑化合物は含まれず、ポルフィリン様色素の含有が認められた。鉄型およびコバルト型ニトリルヒドラタ-ゼのクロ-ニングを行い遺伝子の塩基配列を決定したところ、両遺伝子はきわめて高い相同性を示すことが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Toru Nagasawa: "A novel nitrilase,arylacetonitrilase,of Alcaligenes faecalis JM3 Purification and characterization" European Journal of Biochemistry. 194. 765-772 (1990)
• [Publications] Toru Nagasawa: "eーCaprolactam,a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase" Archieves of Microbiology. 155. 13-17 (1990)
• [Publications] Toru Nagasawa: "Characterization of a new cobaltーcontaining nitrile hydratase purified from ureaーinduced cells of Rhodococcus rhodochrous J1" European Journal of Biochemistry. 196. 581-589 (1991)
• [Publications] Toru Nagasawa: "Optimum culture conditions for the production of cobaltーcontaining nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1" Applied Microbiology Biotechnology. 34. 783-788 (1991)
• [Publications] Michihiko Kobayashi: "Cloning,nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobaltーcontaihing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous J1" Biochimica et Biophysica Acta. 1129. 23-33 (1991)
• [Publications] Makoto Nishiyama: "Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23" Journal of Bacteriology. 173. 2465-2472 (1991)
• [Publications] Toru Nagasawa: "Largeーscale bioconversion of nitriles into useful amides and acids" Van Nostrand Reinhold, 41 (1990)
• [Publications] Toru Nagasawa: "Industrial use of enzymes" Bernard Wolnak and Associates, 8 (1990)