ヘキシュロ-スリン酸シンタ-ゼの構造と機能に関する研究

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02660120
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 加藤 暢夫 鳥取大学, 工学部, 教授 (50026556)
• Keywords: ヘキシュロ-スリン酸シンタ-ゼ / ホスホヘキシュロイソメラ-ゼ / メチロトロ-フ / 安定同位体標識化合物 / フルクト-スー6-リン酸 / ホルムアルデヒド

Research Abstract

ヘキシュ-ロ-スリン酸シンタ-ゼは細菌のC_1化合物代謝の中心の酵素として重要であるばかりでなく,炭素・炭素結合形成反応を触媒する酵素で,生物進化の観点から炭酸固定を触媒するリブロ-スビスリン酸カルボキラ-ゼとの関連が指摘されている.
本年度の研究では,この酵素の触媒機能の最大の特徴である,位置特異的な増炭反応に着目し,^<13>Cホルムアルデヒドからの安定同位体標識化合物の合成を行った.酵素源としては偏性メタノ-ル資化性菌であるMethylomonas aminofaciens77aを用いた.この細菌のメタノ-ル生育菌には,ホスホリボイソメラ-ゼ,ヘキシュロ-スリン酸シンタ-ゼ,ホスホヘキシュロイソメラ-ゼ,およびホスホグルコイソメラ-ゼを高い活性でもっており,この無細胞抽出液を酵素源として用いると,リボ-スー5ーリン酸と^<13>Cーホルムアルデヒドから^<13>Cー標識フルクト-スー6ーリン酸とグルコ-スー6ーリン酸を合成することができた.しかし,細胞抽出液にホルムアルデヒドが存在するため,同位体標識の純度が低下することがわかったので,ヘキシュロ-スリン酸しンタ-ゼおよびホスホヘキシュロイソメラ-ゼを部分精製し,これに市販のホスホリボイソメラ-ゼを加えて反応を行い,高純度の^<13>Cーフルクト-スー6ーリン酸を得ることができた.ここで問題となった点は,反応平衡のために,ホルムアルデヒドが完全に消費されない点であった.この反応では原料として最も高価な^<13>Cーホルムアルデヒドに対する収率が重要であるので,リボ-スー5ーリン酸の濃度を上げて反応平衡を右側に偏らせることを試み,ボ須スー5ーリン酸の濃度を上げて反応平衡を右側に偏らせることを試み,添加したホルムアルデヒドの86%をフルクト-スー6ーリン酸に変換することができた.さらに,ホルムアルデヒドは酵素系にとって毒性が高いため,50mMのホルムアルデヒドを15分おきに添加することにより,90分間の反応で,203mMの^<13>Cーフルクト-スー6ーリン酸の合成に成功した.

Research Products

• [Publications] 加藤 暢夫: "C_1微生物の機能と物質変換" バイオサイエンスとインダストリ-. 49. 20-24 (1991)
• [Publications] H.Yanase: "Production of Dー〔1ー^<13>C〕Fructose 6ーphosphate by a Formaldehydeーfixing System in Methylomonas aminofaciens 77a" Biosci.Biotech.Biochem.56. 541-542 (1992)
• [Publications] H.Yanase: "Enzymatic preparation of〔1ー13C〕Dーfructoseー6ーphosphate from 13Cーformaldehyde and Dーriboseー5ーphosphate using formaldehydeーfixing system of Methylomonas aminofaciens 77a" Appl.Microbiol.Biotechinol.(1992)