1991 Fiscal Year Annual Research Report
血管平滑筋細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaeの活性制御機構
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02670080
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| Research Institution | Niigata University School of Medicine |
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Principal Investigator |
吉田 豊 新潟大学, 医学部, 講師 (40182795)
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| Keywords | cGMP依存性蛋白質リン酸化酵素 / 細胞膜カルシウムポンプ / フォスファチジルイノシト-ル・キナ-ゼ / 血管平滑筋 |
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| Research Abstract |
1.KoskーKosickaらの方法(J.Biol.Chem.,261,3333ー3338,1986)に基づき、ブタ大動脈よりcalmodulin affinity chromatographyで部分精製した細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseが、Gーkinaseにより濃度依存的な強い活性化を受けることが見出された。この活性化に伴い、同酵素標品に存在し、還元条件下のSDSーPAGE上で分子量240kと138kを示す2つの蛋白質がリン酸化されることが見出された。
2.細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseがGーkinaseにより濃度依存的な活性化を受ける条件下で、この二つの蛋白質のリン酸化量を測定したところ、240k蛋白質のリン酸化のみがGーkinaseの濃度に依存して増加し、一方138k蛋白質のリン酸化量は変化していなかった。
3.通常のcalmodulin affinity chromatographyで高度に精製した細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPase標品では、240kおよび138kのリン酸化基質蛋白質は存在せず、またGーkinaseの活性化作用もみられなかった。
4.Gーkinaseによる活性化作用のみられる細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPase部分精製標本をGーkinaseでリン酸化後、新たに開発したcalmodulim affinity chromatographyで分画したところ、240kと138kのGーkinaseリン酸化基質は1M NaClで溶出される画分に回収され、EGTAで溶出される,分子量135kと145kを示す2つの細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseのisoformとは完全に分離した。
5.以上の結果より、Gーkinaseは分子量240kの蛋白質をリン酸化することにより血管平滑筋細胞膜Ca^<2+>ーpumping ATPaseを活性化すると考えられること、また、この活性化にはCa^<2+>ーpumping ATPase自身の直接のリン酸化は関与していないことが示された。
6.現在、240kリン酸化基質蛋白質の同定のための実験が進行中であり、既に、同程度の分子量を示すいくつかの細胞骨格系蛋白質(talin、spectrin、ankyrin,filamin)とは免疫学的に異なる性質を示すことがわかっており、さらに、精製240k蛋白質を用いて、蛋白化学的並びに組替えDNA技術を用いた方法で同定を試みているところである。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] S.Imai: "Sarcolemmal (Ca^<2+>+Mg^<2+>)ーATPase of vascular smooth muscle and the effects of protein kinases." J.Biochem.107. 755-761 (1990)
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[Publications] H.ーT.Sum: "Two high affinity (Ca^<2+>+Mg^<2+>)ーATPases of vascular smooth muscle plasma membrane preparation. Their relation to the Ca^<2+>ーpumping" J.Biochem.108. 730-736 (1990)
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[Publications] Y.Yoshida: "Cyclic GMPーdependent protein kinase stimulates the plasma membrane Ca^<2+>ーpump ATPase of vascular smooth muscle via phosphorylation of a 240ーkDa protein." J.Biol.Chem.266. 19815-19825 (1991)
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[Publications] Y.Yoshida: "Plasma membrane Ca^<2+>ーpump ATPase is not a substrate for cGMPーdependent protein kinase." J.Biochem.(1992)
