1990 Fiscal Year Annual Research Report

カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼのcDNAの導入・発現による生理的機能解析

Research Project

Project/Area Number	02670119
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
Principal Investigator	山内卓東京都神経科学総合研究所, 遺伝学, 副参事研究員 (90041813)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	関原俊一東京都神経科学総合研究所, 遺伝学, 研究員 (40206636) 大伯俊二東京都神経科学総合研究所, 遺伝学, 研究員 (50152103)
Keywords	プロテインキナ-ゼ / カルシウム / カルモデュリン / cDNAの発現 / 培養神経細胞 / 自己リン酸化
Research Abstract	カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼIIのαおよびβサブンニットのcDNAを用いて構造と機能の関係を解析し以下の結果を得た。(1)大腸菌の発現系を用いαとβサブユニットはそれぞれ単独で酵素活性を示すこと,および簡単な操作で均一に精製できた(2)精製したそれぞれのサブユニットは,同様の酵素学的性質を示し,基本的にはラットの脳のキナ-ゼVを同様の性質を示した。(3)様々の変異cDNAを構築し構造と活性の関係を調べた結果,キナ-ゼIIは触媒部位のみで十分な酵素活性を示した(4)この活性はCa^<2+>とカルモデュリンに全く依存せず常に活性型であった。(5)カルモデュリン結合部位の欠失した変異酵素もカルモデュリンに依存しないで酵素活性を示したことから,カルモデュリン結合部位が正確に決定できた,(6)自己リン酸化部位のThr286または自己リン酸化に必要なAlg283を他のアミノ酸に置換すると,Ca^<2+>非依存性活性が出現しなかった。動物培養細胞ヘキナ-ゼIIのcDNAや変異cDNAを導入し発現されることによってキナ-ゼIIの役割を解析し新しい知見を得た。(1)αとβcDNAをCHO細胞で発現させ細胞内分布を調べるとαサブユニットは細胞質と膜画分の両方に存在するが,βサブユニットは細胞質にはほとんど存在せず膜画分に存在する,(2)酵素が膜に結合することにより基質特異性が変化し,酵素活性の調節と細胞内における存在様式が密接に関係すると考えられる。また,細胞内分布はαとβの構成比によって変化する。キナ-ゼIIのcDNAを培養神経細胞に導入し,活性を発現する安定なクロ-ンを得ることができたので,現在,この細胞を用いて解析している。すなわち,cDNAを導入した細胞では導入しない細胞にくらべて形態変化が著しく,どのような蛋白質のリン酸化と神経突起の形成や形態変化が対応するか検討中である。このような実験によりキナ-ゼIIの神経細胞内での役割が明らかになると考えられる。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Yamauchi,T.,Sekihara,S.Ohsako,S: "Subcellular distribution of α and β subunit proteins of Ca^<2+>/Calmodulinーdependent protein kinase II expressed in Chiness hamrter ovary cells" FEBS Lett. 266. 55-58 (1990)
[Publications] Ohsako,S.Watanabe A.Sekihara,S.Ikai,A.Yamauchi T.: "Texpresaion of a catalytically active polypeptide of Calmodulinーdependent protein KinaseII α subunit in Escherichia coli." Biochem Biophys.Res.Commun.170. 705-712 (1990)
[Publications] Satoh,H.,Yamauchi T.Fujisawa.H.: "Purification and Characterization of Calmodulinーdependent protein KinaseII from rat spleen:A new type of Calmodulinーdependent protein KinaseII" J.Biochem.107. 802-809 (1990)
[Publications] Ohsako,S.Nakazawa,H.Sekihara,S.Ikai A,Yamauchi,T.: "Role of Threonire 286 as autophorylation site as appearance of Ca^<2+> independed acting of Calmodulinーdependent Protein Kinase II α subunit" J.Biochem.109. 137-143 (1991)
[Publications] Yamauchi,T.Sekihara.S,Ohsako,S.: "Characterization of Calcium/calmidulinーdependent protein KinaseII isoformo from forebrain and cerekellum" Brain Res. (1991)
[Publications] 山内卓.大迫俊二: "Ca^<2+>カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼII" 生化学. 62. 38-44 (1990)

1990 Fiscal Year Annual Research Report

カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼのcDNAの導入・発現による生理的機能解析

Principal Investigator

山内 卓 東京都神経科学総合研究所, 遺伝学, 副参事研究員 (90041813)

Research Products

[Publications] Yamauchi,T.,Sekihara,S.Ohsako,S: "Subcellular distribution of α and β subunit proteins of Ca^<2+>/Calmodulinーdependent protein kinase II expressed in Chiness hamrter ovary cells" FEBS Lett. 266. 55-58 (1990)

[Publications] Ohsako,S.Watanabe A.Sekihara,S.Ikai,A.Yamauchi T.: "Texpresaion of a catalytically active polypeptide of Calmodulinーdependent protein KinaseII α subunit in Escherichia coli." Biochem Biophys.Res.Commun.170. 705-712 (1990)

[Publications] Satoh,H.,Yamauchi T.Fujisawa.H.: "Purification and Characterization of Calmodulinーdependent protein KinaseII from rat spleen:A new type of Calmodulinーdependent protein KinaseII" J.Biochem.107. 802-809 (1990)

[Publications] Ohsako,S.Nakazawa,H.Sekihara,S.Ikai A,Yamauchi,T.: "Role of Threonire 286 as autophorylation site as appearance of Ca^<2+> independed acting of Calmodulinーdependent Protein Kinase II α subunit" J.Biochem.109. 137-143 (1991)

[Publications] Yamauchi,T.Sekihara.S,Ohsako,S.: "Characterization of Calcium/calmidulinーdependent protein KinaseII isoformo from forebrain and cerekellum" Brain Res. (1991)

[Publications] 山内 卓.大迫 俊二: "Ca^<2+>カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼII" 生化学. 62. 38-44 (1990)

山内卓東京都神経科学総合研究所, 遺伝学, 副参事研究員 (90041813)

[Publications] 山内卓.大迫俊二: "Ca^<2+>カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼII" 生化学. 62. 38-44 (1990)