1991 Fiscal Year Annual Research Report
ビブリオ属菌の新規なポリアミン生合成酵素群遺伝子のクロ-ニングと解析
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02670182
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
山本 重雄 岡山大学, 薬学部, 助教授 (40033229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
篠田 純男 岡山大学, 薬学部, 教授 (50029782)
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| Keywords | ビブリオ / ポリアミン / クロ-ニング / 酵素遺伝子 / 塩基配列 / Acinetobacter |
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| Research Abstract |
1.組換えDNA選別と酵素遺伝子の大腸菌での発現 Carboxynorspermidine decarboxylase(CANS DC)及びLー2,4ーdiaminobutyrate decarboxylase(DABADC)に対する抗体を調製し,ライブラリ-よりイムノスクリ-ニングによって陽性クロ-ンを選別した。CANS DCについては16個の陽性クロ-ンのうち1個(pCDC14)にV.alginolyticusの粗抽出液の約3倍の比活性が認められた。一方,DABA DCについては10万コロニ-以上をスクリ-ニングし,57個の陽性クロ-ンを得たが,いずれにも酵素活性は認められなかった。本酵素はサブユニットが11万の4量体で,しかもNー末端アミノ酸がSerであることなどの理由から,酵素活性の発現には何らかの障害があると考えられた。
2.CANS DC遺伝子(nspC)のマッピングとサブクロ-ニング 本遺伝子は約4kbpのDNA断片中に存在し,PvuII,EcoRI,SalI,SacI,HincIIの切断個所が1個ずつ存在していた。SalI断片をpUC18に逆位に挿入しても、酵素活性の変化は認められず,プロモ-タ-領域もクロ-ニングされていることが明らかとなった。数種の欠失プラスミドを作成し,酵素活性を測定したところ,EcoRIで切り出される最小断片2Kbp(pcDC14ー1)にnspCが存在することが判明した。
3.nspCの塩基及びアミノ酸配列の決定と解析 pCDC14ー1よりnested欠失プラスミドを作成し,特にpromoter及びterminator領域を重点的にシ-ケンスした。その結果,既に決定したMetから始まる20種のアミノ酸配列に対応する塩基配列が同定できた。また,ー35,ー10のプロモ-タ-領域及びSD配列が認められた。一方,3'ー領域の妥当な部分にTAA terminationコドンとpー非依存在のterminator領域が同定された。以上の結果は,nspCの全領域がクロ-ニングされたことを示している。
4.DABA DCの他細菌における分布 Acinetobacte calcoaceticusよりDA BA DCを精製し,V.alginolyticus DABA DCとNー末端アミノ酸配列,抗原性などを比較し,興味深い差異を明らかにした。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Hiroshi Nakao: "Purification and some properties of carboxynorspermidine synthase participating in a novel biosynthetic pathway for norspermidine in Vibrio alginolyticus" Journal of General Microbiology. 137. 1737-1742 (1991)
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[Publications] Shigeo Yamamoto: "Occurrence of Lー2,4ーdiaminobutyrate decarboxylase activity in Acinetobacter" Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 39. 2451-2453 (1991)
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[Publications] Shigeo Yamamamoto: "Purification and characterization of Lー2,4ーdiaminobutyrate decarboxylase from Acinetobacter calcoaceticus" Journal of General Microbiology.
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[Publications] Shigeo Yamamoto: "Cloning,sequencing and expression of the gene from Vibrio alginolyticus encoding carboynorspermidine decarboxylase" Journal of General Microbiology.
