1991 Fiscal Year Annual Research Report
血管平滑筋におけるミオシン軽鎖ホスファタ-ゼのDNAクロ-ニング
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02670389
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
小西 得司 三重大学, 医学部, 助教授 (40115704)
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| Keywords | 平滑筋 / ミオシン / リン酸化反応 / ホスファタ-ゼ |
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| Research Abstract |
平滑筋ホスファタ-ゼのcDNAクロ-ニングとして,1型(PPー1)及び2A型(PPー2A)ホスファタ-ゼにアミノ酸配列が相同な部分である ^<149>YーGーPーYーDーEー ^<155>C(アミノ酸の左肩の数字はウサギ骨格筋PPー1αのN端よりの番号を示す)、PPー1とのみ相同である ^<66>HーGーQーYーYー ^<71>D, ^<134>WーKーTーPーTーDー ^<140>C, ^<169>IーPーCーCーHーGー ^<175>G, ^<273>CーGーEーPーDーNー ^<279>Aに対する混合Oligonuclectideを作成して,5'末端を ^<32>Pにて標識しニワトリ砂嚢cDNAライブラリ(λgt11),3×10^5pfuのスクリ-ニングを行ったが、5種類のOligonuclectideの内2種類以上に陽性を示すプラ-クは得られなかった。さらに,これらOligonucleotideをプライマ-として同ライブラリ-をPCR法にて検討したが,DNAは増幅されなかった。そこで,ミオシン軽鎖ホスファタ-ゼ(MLCP)がどのタイプに属するかを検討するため,MLCPの精製を行った。まずニワトリ砂嚢より精製したアクトミオシンよりホスファタ-ゼを高Mg^<2+>下に抽出し,DEAEーCellulofine,HeparineーSepharose,Thiophosphorylated MLCーSepharoseを用いて精製に成功した。精製されたホスファタ-ゼは,SDSーPAGE上58kDaと38kDaよりなり、ミオシン分子内燐酸化軽鎖を脱燐酸化することより,MLCPであることが確認された。このMLCPは、Co^<2+>又はMn^<2+>存在下にその活性が数倍上昇し,このCo^<2+>依存性の活性は骨格筋Inhibitor2により阻害された。また,このMLCP活性はオカダ酸によっても阻害され,そのIC_<50>値は10^<-7>M程度であった。以上より,平滑筋MLCPはPPー1の性質を有しているが、いままで報告されているPPー1及びPPー2AよりデザインしたOligonucleotideによりcDNAライブラリ-からのクロ-ニングができず,さらにPCR法にてもDNA増幅ができないことより、いままで報告されているPPー1とはそのアミノ酸一次構造の相同性が低いことが示唆された。
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[Publications] 伊藤 正明: "平滑筋収縮におけるカルシウムーカルモデュリン調節機構" Therapeutic Research. 13. (1992)
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[Publications] Hiroo Itoh: "Contraction of rat thoracic aorta strips by endothelinー1 in the abscence of extracellular Ca^<2+>" Britisch Journal of Pharmacology. 104. 847-852 (1991)
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[Publications] Hiroo Itoh: "Contractile actions of eudothelinー1 in isolated helical strips from rat pulmonary artery:potentiation of serotoninーinduced contraction" Journal of Candiovascular Pharmacology. (1992)
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[Publications] Shinya Okamoto: "Effects of trapedil on restenosis after PTCA in patients with coronary artery disease" American Heart Journal. (1992)
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[Publications] Shinya Okamoto: "American Journal of Cardiology" Gaーenhanced magnetic resonance imaging in hypertrophic cardiomyopathy, 1992
